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外源性左旋肉碱对过度内质网应激介导的严重烫伤大鼠肝细胞焦亡的影响及其分子机制

樊拂晓 李朋涛 夏正国 谢超琼 徐结苟 徐庆连

樊拂晓, 李朋涛, 夏正国, 等. 外源性左旋肉碱对过度内质网应激介导的严重烫伤大鼠肝细胞焦亡的影响及其分子机制[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2022, 38(7): 667-676. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20220120-00010.
引用本文: 樊拂晓, 李朋涛, 夏正国, 等. 外源性左旋肉碱对过度内质网应激介导的严重烫伤大鼠肝细胞焦亡的影响及其分子机制[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2022, 38(7): 667-676. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20220120-00010.
Fan FX,Li PT,Xia ZG,et al.Effects and molecular mechanism of exogenous L-carnitine on excessive endoplasmic reticulum stress-mediated hepatic pyroptosis in severely scald rats[J].Chin J Burns Wounds,2022,38(7):667-676.DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20220120-00010.
Citation: Fan FX,Li PT,Xia ZG,et al.Effects and molecular mechanism of exogenous L-carnitine on excessive endoplasmic reticulum stress-mediated hepatic pyroptosis in severely scald rats[J].Chin J Burns Wounds,2022,38(7):667-676.DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20220120-00010.

外源性左旋肉碱对过度内质网应激介导的严重烫伤大鼠肝细胞焦亡的影响及其分子机制

doi: 10.3760/cma.j.cn501225-20220120-00010
基金项目: 

安徽省科技攻关项目 1604a0802083

详细信息
    通讯作者:

    徐结苟,Email:xujiegou@ahmu.edu.cn

    徐庆连,Email:xuqinglian@sina.com

Effects and molecular mechanism of exogenous L-carnitine on excessive endoplasmic reticulum stress-mediated hepatic pyroptosis in severely scald rats

Funds: 

Key Science and Technology Project in Anhui Province of China 1604a0802083

    Corresponding authors: Xu Jiegou, Email: xujiegou@ahmu.edu.cn;  Xu Qinglian, Email: xuqinglian@sina.com
  • 摘要:
    目的 探讨外源性左旋肉碱对过度内质网应激介导的严重烫伤大鼠肝细胞焦亡的影响及其分子机制。
    方法 采用实验研究方法。将15只6~8周龄雌性SD大鼠按随机数字表法(分组方法下同)分为假伤组、单纯烫伤组、烫伤+肉碱组,每组5只,单纯烫伤组和烫伤+肉碱组大鼠背部制作30%体表总面积的Ⅲ度烫伤,其中烫伤+肉碱组大鼠另外给予腹腔注射左旋肉碱。伤后72 h,采用全自动生化仪检测肝损伤生物化学指标天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)水平,样本数为5。伤后72 h,采用苏木精-伊红染色观察肝组织损伤情况。伤后72 h,采用实时荧光定量反转录PCR(RT-qPCR)法检测肝组织中细胞焦亡相关标志物核苷酸结合寡聚化结构域蛋白样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶1(caspase-1)、消皮素D和白细胞介素1β(IL-1β)以及内质网应激相关标志物葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)的mRNA水平;采用蛋白质印迹法检测肝组织中GRP78、CHOP、NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白表达水平,样本数均为5。取人肝癌细胞HepG2,分为二甲基亚砜(DMSO)组、0.1 μmol/L衣霉素组、0.2 μmol/L衣霉素组、0.4 μmol/L衣霉素组、0.8 μmol/L衣霉素组,分别作相应处理。培养24 h后,采用细胞计数试剂盒8法检测细胞活力并筛选衣霉素干预浓度(样本数为5)。取HepG2人肝癌细胞,分为DMSO组、单纯衣霉素组和衣霉素+肉碱组,分别作相应处理。培养24 h后,采用蛋白质印迹法检测细胞中GRP78、CHOP、NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白表达水平,样本数均为3。对数据行单因素方差分析和LSD-t检验。
    结果 伤后72 h,单纯烫伤组大鼠血清中AST和ALT水平分别为(640±22)、(157±8)U/L,均分别明显高于假伤组的(106±13)、(42±6)U/L(t值分别为-46.78、-25.98,P<0.01);烫伤+肉碱组大鼠血清中AST和ALT水平分别为(519±50)、(121±10)U/L,均明显低于单纯烫伤组(t值分别为4.93、6.06,P<0.01)。伤后72 h,假伤组大鼠肝组织形态基本正常,未见明显的炎症细胞浸润;与假伤组相比,单纯烫伤组大鼠肝组织可见大量的炎症细胞浸润,细胞排列紊乱;与单纯烫伤组相比,烫伤+肉碱组大鼠肝组织可见少量的炎症细胞浸润。伤后72 h,单纯烫伤组大鼠肝组织中NLRP3、caspase-1、消皮素D和IL-1β mRNA表达水平均明显高于假伤组(t值分别为34.42、41.93、30.17、15.68,P<0.01);烫伤+肉碱组大鼠肝组织中NLRP3、caspase-1、消皮素D和IL-1β mRNA表达水平均明显低于单纯烫伤组(t值分别为34.40、37.20、19.95、7.88,P<0.01)。伤后72 h,与假伤组相比,单纯烫伤组大鼠肝组织中NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白表达水平均明显升高(t值分别为12.28、26.92、5.20、10.02、24.78,P<0.01);与单纯烫伤组相比,烫伤+肉碱组大鼠肝组织中NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白表达水平均明显下降(t值分别为10.99、27.96、12.69、8.96、12.27,P<0.01)。伤后72 h,单纯烫伤组大鼠肝组织中GRP78、CHOP的mRNA水平均明显高于假伤组(t值分别为21.00、16.52,P<0.01),烫伤+肉碱组大鼠肝组织中GRP78、CHOP的mRNA水平均明显低于单纯烫伤组(t值分别为8.92、8.21,P<0.01);单纯烫伤组大鼠肝组织中GRP78、CHOP的蛋白表达水平均明显高于假伤组(t值分别为22.50、14.29,P<0.01),烫伤+肉碱组大鼠肝组织中GRP78、CHOP的蛋白表达水平均明显低于单纯烫伤组(t值分别为14.29、5.33,P<0.01)。培养24 h后,与DMSO组相比,0.1 μmol/L衣霉素组、0.2 μmol/L衣霉素组、0.4 μmol/L衣霉素组、0.8 μmol/L衣霉素组细胞存活率均明显下降(t值分别为4.90、9.35、18.64、25.09,P<0.01);选择0.8 μmol/L作为后续衣霉素的干预浓度。培养24 h后,与DMSO组相比,单纯衣霉素组细胞GRP78、CHOP的蛋白表达水平均明显升高(t值分别为10.48、17.67,P<0.01);与单纯衣霉素组相比,衣霉素+肉碱组细胞GRP78、CHOP的蛋白表达水平均明显下降(t值分别为8.08、13.23,P<0.05或P<0.01)。培养24 h后,与DMSO组相比,单纯衣霉素组细胞NLRP3、消皮素D-N蛋白表达水平均明显升高(t值分别为13.44、27.51,P<0.01),caspase-1、caspase-1/p20、剪切型IL-1β蛋白表达水平均无明显变化(P>0.05);与单纯衣霉素组相比,衣霉素+肉碱组细胞NLRP3、消皮素D-N蛋白表达水平均明显下降(t值分别为20.49、21.95,P<0.01),caspase-1、caspase-1/p20、剪切型IL-1β蛋白表达水平均无明显变化(P>0.05)。
    结论 在严重烫伤大鼠中,外源性左旋肉碱可能通过抑制过度内质网应激介导的细胞焦亡相关通路发挥对肝损伤的保护作用。

     

  • 假伤组与2个严重烫伤组大鼠伤后72 h肝组织损伤情况 苏木精-伊红×400,图中标尺为50 μm。1A.假伤组大鼠肝组织中的细胞排列规则,未见明显的炎症细胞浸润;1B.单纯烫伤组大鼠肝组织中可见大量的炎症细胞浸润,细胞排列紊乱,并可见弥漫的脂肪病变;1C.烫伤+肉碱组大鼠肝组织中可见少量的炎症细胞浸润以及散在的脂肪病变

    注:图中箭头所指部位为病变部位

    假伤组与2个严重烫伤组大鼠伤后72 h肝组织中细胞焦亡相关标志物表达水平。2A. 实时荧光定量反转录PCR条图(样本数均为5,x¯±s);2B、2C.分别为蛋白质印迹法的条带图及其对应的条图(样本数均为5,x¯±s

    注:NLRP3为核苷酸结合寡聚化结构域蛋白样受体热蛋白结构域相关蛋白3,caspase-1为胱天蛋白酶1,IL-1β为白细胞介素1β,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶;条图横坐标下和条带图上方1、2、3分别为假伤组、单纯烫伤组、烫伤+肉碱组;图2A中3组间NLRP3、caspase-1、消皮素D、IL-1β总体比较,F值分别为1 141.59、1 652.32、644.00、144.40,P值均<0.001;图2A中与假伤组比较,aP<0.01;与单纯烫伤组比较,bP<0.01;图2C中3组间NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白总体比较,F值分别为146.94、373.25、77.72、91.26、220.51,P值均<0.001;图2C中与假伤组比较,aP<0.01,与单纯烫伤组比较,bP<0.01

    假伤组与2个严重烫伤组大鼠伤后72 h肝组织中内质网应激相关标志物表达水平。3A. 实时荧光定量反转录PCR条图(样本数均为5,x¯±s);3B、3C.分别为蛋白质印迹法的条带图及其对应条图(样本数均为5,x¯±s

    注:GRP78为葡萄糖调节蛋白78,CHOP为CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶;条图横坐标下和条带图上方的1、2、3分别为假伤组、单纯烫伤组、烫伤+肉碱组;图3A中3组间GRP78、CHOP总体比较,F值分别为268.17、160.76,P值均<0.001;图3A中与假伤组比较,aP<0.01,与单纯烫伤组比较,bP<0.01;图3C中3组间GRP78、CHOP总体比较,F值分别为164.63、30.88,P值均<0.001;图3C中与假伤组比较,aP<0.01,与单纯烫伤组比较,bP<0.01

    培养24 h后5组HepG2细胞活力比较(样本数均为5,x¯±s

    注:DMSO为二甲基亚砜;图中横坐标下方1、2、3、4、5分别为DMSO组、0.1 μmol/L衣霉素组、0.2 μmol/L衣霉素组、0.4 μmol/L衣霉素组、0.8 μmol/L衣霉素组;5组间总体比较F=107.08,P<0.001;与DMSO组比较,aP<0.01

    3组HepG2细胞培养24 h后内质网应激相关标志物蛋白表达水平比较。5A、5B.分别为条带图及其对应的条图(样本数均为3,x¯±s

    注:GRP78为葡萄糖调节蛋白78,CHOP为CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶;图5A条带上方及图5B横坐标下方的1、2、3分别为二甲基亚砜组、单纯衣霉素组、衣霉素+肉碱组;图5B中3组间GRP78、CHOP总体比较,F值分别为69.72、318.45,P值均<0.001;图5B中与DMSO组比较,aP<0.01;与单纯衣霉素组比较,bP<0.05,cP<0.01

    3组HepG2细胞培养24 h后细胞焦亡相关标志物蛋白表达水平比较。6A、6B.分别为条带图及其对应条图(样本数均为3,x¯±s

    注:NLRP3为核苷酸结合寡聚化结构域蛋白样受体热蛋白结构域相关蛋白3,caspase-1为胱天蛋白酶1,IL-1β为白细胞介素1β,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶;图6A条带上方及图6B横坐标下方的1、2、3分别指二甲基亚砜(DMSO)组、单纯衣霉素组、衣霉素+肉碱组;图6B中3组间NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N和剪切型IL-1β总体比较,F值分别为306.32、0.44、5.28、464.71、4.90,P值分别为<0.001、0.664、0.048、<0.001、0.055;图6B中与DMSO组比较,aP<0.01;与单纯衣霉素组比较,bP<0.01

    表1  实时荧光定量反转录PCR法检测大鼠肝组织中内质网应激与细胞焦亡相关标志物mRNA的引物序列及产物大小

    基因名称引物序列(5'→3')产物大小(bp)
    GRP78上游:GATGTAGGCACGGTGGTTGG下游:GTGAAGGCCACATACGACGG131
    CHOP上游:AAGCCCTCGCTCTCCAGATT下游:TCCTTCATGCGCTGTTTCCC132
    NLRP3上游:CAGCGATCAACAGGCGAGAC下游:AGAGATATCCCAGCAAACCTATCCA141
    caspase-1上游:GACAAGATCCTGAGGGCAAA下游:GGTCTCGTGCCTTTTCCATA163
    消皮素D上游:GGCAGCATCCTTGAGTGTCT下游:ATGGGGTGCTCTGTTCCAAG199
    IL-1β上游:AGGCTTCCTTGTGCAAGTGT下游:TGAGTGACACTGCCTTCCTG230
    GAPDH上游:AGACAGCCGCATCTTCTTGT下游:CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT207
    注:GRP78为葡萄糖调节蛋白78,CHOP为CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白,NLRP3为核苷酸结合寡聚化结构域蛋白样受体热蛋白结构域相关蛋白3,caspase-1为胱天蛋白酶1,IL-1β为白细胞介素1β,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶
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    表2  假伤组与2个严重烫伤组大鼠伤后72 h血清中AST和ALT含量比较(U/L,x¯±s

    组别鼠数(只)ASTALT
    假伤组5106±1342±6
    单纯烫伤组5640±22157±8
    烫伤+肉碱组5519±50121±10
    F372.98252.14
    P<0.001<0.001
    t1-46.78-25.98
    P1<0.001<0.001
    t24.936.06
    P20.001<0.001
    注:AST为天冬氨酸转氨酶,ALT为丙氨酸转氨酶;F值、P值为3组间各指标总体比较所得;t1值、P1值为单纯烫伤组与假伤组各指标比较所得;t2值、P2值为烫伤+肉碱组与单纯烫伤组各指标比较所得
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-01-20
  • 网络出版日期:  2022-08-12
  • 刊出日期:  2022-08-17

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