制备含氧化石墨烯（GO）的甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）水凝胶并探讨原位光聚合GO-GelMA复合水凝胶对小鼠全层皮肤缺损创面血管化的影响。

采用实验研究方法。将0.2 mg/mL的GO溶液50 μL均匀涂抹于导电胶上，烘干后于场发射扫描电子显微镜下观察GO的结构和大小。将人皮肤成纤维细胞（HSF）分为采用相应终质量浓度GO处理的0 μg/mL GO（不加GO溶液，下同）组、0.1 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组、10.0 μg/mL GO组，用酶标仪检测细胞培养48 h的吸光度值，以此表示细胞增殖活性（样本数为6）。将HSF和人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）分别分为采用相应终质量浓度GO处理的0 μg/mL GO组、0.1 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组，采用划痕试验检测划痕后24、36 h HSF的迁移率（样本数为5）及划痕后12 h HUVEC的迁移率（样本数为3），采用酶联免疫吸附测定法检测培养4、6、8 h后HSF分泌的血管内皮生长因子（VEGF）水平（样本数为3）。将配制的含相应终质量浓度GO的GO-GelMA复合水凝胶设为0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组，观察其交联前后的性状，检测用磷酸盐缓冲液浸泡3、7 d后GO的释放情况（样本数为3）。在16只6周龄雌性C57BL/6小鼠背部制作全层皮肤缺损创面，将采用原位交联的含相应终质量浓度GO的GO-GelMA复合水凝胶处理的小鼠按随机数字表法分为0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组，每组4只，观察治疗3、7、14 d创面大体情况并计算创面愈合率，采用激光多普勒血流仪检测治疗3、7、14 d创面血流灌注并计算平均灌注单位（MPU）比值，采用苏木精-伊红染色观察治疗7 d创面血管新生情况并计算血管密度（样本数均为3）。取0 μg/mL GO复合水凝胶组和0.1 μg/mL GO复合水凝胶组治疗7 d的创面组织，采用苏木精-伊红染色观察GO分布与血管新生的关系（样本数为3），行免疫组织化学染色后观察VEGF的表达。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析、Tukey法。

GO为多层片状结构，宽度约为20 μm、长度约为50 μm。培养48 h，10.0 μg/mL GO组HSF的吸光度值明显低于0 μg/mL GO组（q=7.64，P<0.01）。划痕后24 h，4组HSF迁移率相近（P>0.05）；划痕后36 h，0.1 μg/mL GO组HSF迁移率明显高于0 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组（q值分别为7.48、10.81、10.20，P值均<0.01）。划痕后12 h，0.1 μg/mL GO组HUVEC迁移率明显高于0 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组（q值分别为7.11、8.99、14.92，P值均<0.01），5.0 μg/mL GO组HUVEC迁移率明显低于0 μg/mL GO组和1.0 μg/mL GO组（q值分别为7.81、5.33，P<0.05或P<0.01）。培养4、6 h，4组HSF的VEGF表达均相近（P>0.05）；培养8 h，0.1 μg/mL GO组HSF的VEGF表达明显高于0 μg/mL GO组和5.0 μg/mL GO组（q值分别为4.75、4.48，P值均<0.05）。4组GO-GelMA复合水凝胶在交联前均呈红色液体状，交联后呈微黄色凝胶状且流动性无明显差异。0 μg/mL GO复合水凝胶组复合水凝胶各时间点均无GO释放，其余3组GO-GelMA复合水凝胶中的GO于浸泡3 d部分释放，至浸泡7 d全部释放。治疗3~14 d，4组小鼠创面可见水凝胶敷料覆盖在位并保持湿润，创面逐渐愈合。治疗3、7、14 d，4组小鼠创面愈合率均相近（P>0.05）。治疗3 d，0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面MPU比值明显高于0 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组（q值分别为10.70、11.83、10.65，P<0.05或P<0.01）。治疗7、14 d，4组小鼠创面MPU比值均相近（P>0.05）。0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面治疗7 d的MPU比值明显低于治疗3 d（q=14.38，P<0.05），治疗14 d的MPU比值明显低于治疗7 d（q=27.78，P<0.01）。治疗7 d，0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面新生血管密度为每200倍视野下（120.7±4.1）根，明显高于0 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组的每200倍视野下（61.7±1.3）、（77.7±10.2）、（99.0±7.9）根（q值分别为12.88、7.79、6.70，P值均<0.01）；1.0 μg/mL GO复合水凝胶组和5.0 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面新生血管密度均明显高于0 μg/mL GO复合水凝胶组（q值分别为5.10、6.19，P<0.05）。治疗7 d，相较于0 μg/mL GO复合水凝胶组，0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面中成簇新生血管更多，且聚集于GO附近；0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面中GO和新生血管分布区域有大量VEGF表达。

GO质量浓度低于10.0 μg/mL对HSF增殖活性无明显影响，0.1 μg/mL的GO能够促进HSF和HUVEC迁移，能促进HSF分泌VEGF。原位光聚合GO-GelMA复合水凝胶敷料能够通过促进小鼠全层皮肤缺损创面血管新生，增加创面早期血流灌注，且GO对新生血管有富集作用，其机制可能与GO促进创面细胞分泌VEGF相关。

基于单细胞RNA测序探讨小鼠全层皮肤缺损创面中真皮成纤维细胞（dFb）的异质性与生长因子调控网络。

采用实验研究方法。取5只8周龄雄性健康C57BL/6小鼠（鼠龄、性别、品系下同）正常皮肤组织，另取5只背部全层皮肤缺损小鼠伤后7 d创面组织，用胶原酶D和DNA酶Ⅰ消化组织获得细胞悬液，用10x Genomics平台构建测序文库，用Illumina Novaseq6000测序仪进行单细胞RNA测序。采用R4.1.1软件的Seurat 3.0程序分析获得2种组织细胞的基因表达矩阵，采用按细胞群、细胞来源、标记皮肤中主要细胞基因分类的二维tSNE云图进行可视化展示。根据已有文献报道和CellMarker数据库检索情况，分析2种组织细胞的基因表达矩阵中标志基因表达情况，对各细胞群进行编号和定义。将基因表达矩阵和细胞分群信息导入R4.1.1软件的CellChat 1.1.3程序，分析2种组织中细胞间通信以及创面组织血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）信号通路中的细胞间通信，2种组织中FGF的各亚型与FGF受体（FGFR）各亚型的两两配对（以下简称FGF配受体对）对FGF信号网络的相对贡献，2种组织中相对贡献排名前2的FGF配受体对信号通路中的细胞间通信。取1只健康小鼠正常皮肤组织和1只全层皮肤缺损小鼠伤后7 d创面组织，行多重免疫荧光染色，检测FGF7蛋白的表达与分布及其与二肽基肽酶4（DPP4）、干细胞抗原1（SCA1）、平滑肌肌动蛋白（SMA）和PDGF受体α（PDGFRα）的蛋白共定位表达。

健康小鼠正常皮肤组织和全层皮肤缺损小鼠伤后7 d创面组织中均包含25个细胞群，但2种组织中各细胞群中细胞数不一致。PDGFRα、血小板内皮细胞黏附分子1、淋巴管内皮透明质酸受体1、受体型蛋白酪氨酸磷酸酶C、角蛋白10和角蛋白79基因在二维tSNE云图上均有各自明确的分布，分别指示特定的细胞群。将25个细胞群按C0~C24编号，分为9个dFb亚群和16个非dFb群，dFb亚群包括C0间质祖细胞、C5脂肪前体细胞、C13具有收缩能力的肌肉细胞相关成纤维细胞等，非dFb群包括C3中性粒细胞、C8 T细胞、C18红细胞等。与健康小鼠正常皮肤组织比较，全层皮肤缺损小鼠伤后7 d创面组织中细胞间通信更多更密集，其中细胞间通信强度排前3位的细胞群为dFb亚群C0、C1、C2，这3个dFb亚群与创面组织中其他细胞群之间均有通信。在全层皮肤缺损小鼠伤后7 d创面组织中，VEGF信号主要由dFb亚群C0发送、脉管相关细胞群C19和C21接收，PDGF信号主要由周细胞C14发送、多个dFb亚群接收，EGF信号主要由角质形成细胞亚群C9和C11发送、dFb亚群C0接收，FGF信号的主要发送者和接收者均为dFb亚群C6。健康小鼠正常皮肤组织和全层皮肤缺损小鼠伤后7 d创面组织FGF信号网络中的FGF配受体对相对贡献，均是FGF7-FGFR1排在首位，排名第2的分别是FGF7-FGFR2、FGF10-FGFR1；与正常皮肤组织比较，创面组织FGF7-FGFR1信号通路中的细胞间通信更多，而FGF7-FGFR2和FGF10-FGFR1信号通路中的细胞间通信稍有减少或无明显变化；创面组织FGF7-FGFR1信号通路中的细胞间通信强于FGF7-FGFR2、FGF10-FGFR1信号通路；在2种组织中，FGF7信号均主要由dFb亚群C0与C1和C2发送、dFb亚群C6和C7接收。与健康小鼠正常皮肤组织比较，全层皮肤缺损小鼠伤后7 d创面组织中FGF7蛋白表达更多；在正常皮肤组织中，FGF7蛋白主要表达于皮肤间质层且在靠近真皮白色脂肪组织附近也有表达；在2种组织中，FGF7蛋白与DPP4、SCA1蛋白共定位表达于皮肤间质层中，与PDGFRα蛋白共定位表达于dFb中，与SMA蛋白无共定位表达，其中创面组织中的共定位表达多于正常皮肤组织。

小鼠全层皮肤缺损创面愈合过程中的dFb存在高异质性，为多种生长因子潜在的主要分泌或接收细胞群落，与生长因子信号通路之间存在紧密、复杂的联系；FGF7-FGFR1信号通路是创面愈合过程中的主要FGF信号通路，靶向调控多个dFb亚群。

探讨负载银和重组人碱性成纤维细胞生长因子（rh-bFGF）的甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）水凝胶对兔深Ⅱ度烧伤创面的影响。

采用实验研究方法。制备含不同浓度甲基丙烯酸酐（MA）的低浓度MA明胶（GelMA）材料、中浓度GelMA材料和高浓度GelMA材料，加入光引发剂后分别制得低浓度GelMA水凝胶、中浓度GelMA水凝胶和高浓度GelMA水凝胶。采用核磁共振波谱仪检测前述3种浓度GelMA材料的氢核磁共振谱并根据波谱图计算其取代度，采用场发射扫描电子显微镜（FESEM）检测前述3种浓度GelMA水凝胶的三维微观结构及孔径，样本数均为9。根据前述筛选出的MA浓度合成含10种浓度银的GelMA（含银GelMA）溶液，将每种浓度的含银GelMA溶液均分为3份，加入光引发剂后分别暴露于紫外光下持续20、25、35 s，制得相应的含银GelMA水凝胶。采用胶原酶降解法测定不同光交联时间含银GelMA水凝胶降解12、24、36、48 h的降解剩余率及彻底降解所需时长，样本数为5。测定前述筛选出光交联时间下含10种浓度银GelMA水凝胶对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径反映其抑菌能力，样本数均为5。以与含最低浓度银（即不含银）GelMA水凝胶抑菌圈直径相比有统计学意义的含银GelMA水凝胶为有抑菌活性。选取具有抑菌活性的且载药浓度最低的含银GelMA水凝胶，采用FESEM检测其三维微观结构及孔径，采用能谱仪检测其内部银元素的存在情况，样本数均为9。将冻干单纯GelMA水凝胶和冻干含银GelMA水凝胶分别浸没于磷酸盐缓冲液中24 h，通过称重法计算并比较2种水凝胶的溶胀率，样本数为5。根据预实验及前述实验结果，制备含银和rh-bFGF的GelMA水凝胶（简称复合水凝胶）。大体观察复合水凝胶的外观，并采用FESEM检测其三维微观结构与孔径。取30只4~6个月龄、雌雄各半日本大耳兔，在其背部制作深Ⅱ度烧伤创面。以兔头侧为基准，将脊柱左侧创面作为复合水凝胶治疗组，右侧作为纱布对照组，2组创面分别作相应处理。观察伤后3、7、14、21、28 d创面愈合情况；记录伤后7、14、21、28 d创面愈合面积并计算其愈合率，样本数为30。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析、独立样本t检验。

低浓度GelMA材料、中浓度GelMA材料及高浓度GelMA材料的取代度，差异明显（F=1 628.00，P<0.01）。低浓度GelMA水凝胶存在疏松、不规则三维空间网状结构，孔径为（60±17）μm；中浓度GelMA水凝胶的三维空间网络、孔径大小均较均匀规则，孔径为（45±13）μm；高浓度GelMA水凝胶的三维空间网状结构致密、层次混乱，孔径为（25±15）μm。3种GelMA水凝胶孔径大小差异有统计学意义（F=12.20，P<0.01），选取（MA）中浓度为后续材料制作浓度。相同光交联时间下的含不同浓度银GelMA水凝胶的降解性基本一致；20、25、35 s光交联时间下含银GelMA水凝胶降解12 h的降解剩余率分别为（74.2±1.7）%、（85.3±0.9）%、（93.2±1.2）%，降解24 h的降解剩余率分别为（58.3±2.1）%、（65.2±1.8）%、（81.4±2.6）%，降解36 h的降解剩余率分别为（22.4±1.9）%、（45.2±1.7）%、（68.1±1.4）%，降解48 h的降解剩余率分别为（8.2±1.7）%、（32.4±1.3）%、（54.3±2.2）%；20、25、30 s光交联时间下含银GelMA水凝胶彻底降解所需时间分别为（50.2±2.4）、（62.4±1.4）、（72.2±3.2）h，差异有统计学意义（F=182.40，P<0.01），选取25 s作为后续光交联时间。低浓度至高浓度的10种含银GelMA水凝胶对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径依次为（2.6±0.4）、（2.5±0.4）、（3.2±0.4）、（12.1±0.7）、（14.8±0.7）、（15.1±0.5）、（16.2±0.6）、（16.7±0.5）、（16.7±0.4）、（16.7±0.6）mm，基本呈浓度依赖性升高趋势，总体比较差异有统计学意义（F=428.70，P<0.01），与含最低浓度银GelMA水凝胶相比，其他有抑菌活性的含低浓度至高浓度银GelMA水凝胶的抑菌圈直径均明显增大（t值分别为26.35、33.84、43.65、42.17、49.24、55.74、43.72，P<0.01）。对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为（12.1±0.7）mm的含银GelMA水凝胶具有抑菌活性且载药浓度最低，选取该含银浓度为后续材料制作浓度。含银GelMA水凝胶的微观形貌为规律的趋于平行线性的条索状结构，孔径为（45±13）μm，且含有银元素。浸没24 h，含银GelMA水凝胶的溶胀率与单纯GelMA水凝胶相近（P>0.05）。复合水凝胶呈无色清亮透明状；其三维结构为规则、均匀的网格状，内部存在细丝网状结构，孔径为（40±21）μm。伤后3 d，复合水凝胶组兔创面可见大量坏死组织及渗出物；纱布对照组兔创面可见散在结痂，亦可见少量坏死组织及渗出物。伤后7 d，复合水凝胶组兔创面已明显缩小，纱布对照组兔出现创面存在与纱布粘连情况。伤后14 d，复合水凝胶组兔创面红润、可见肉芽组织生长；纱布对照组兔创面基底呈苍白色、血运差。伤后21 d，复合水凝胶组兔创面完全愈合，纱布对照组兔创面出现愈合趋势。伤后28 d，复合水凝胶组兔创面部位可见新生毛发，纱布对照组兔仍残存椭圆形创面。伤后7、14、21、28 d，复合水凝胶组兔创面愈合率均明显大于纱布对照组（t值分别为2.24、4.43、7.67、7.69，P<0.05或P<0.01）。

中浓度GelMA水凝胶在溶胀性、可降解性方面具有良好的理化特性，筛选出的含银GelMA水凝胶具有抑菌活性且载药浓度最低，制得的复合水凝胶可明显缩短兔深Ⅱ度烧伤创面愈合时间。

探讨外源性左旋肉碱对过度内质网应激介导的严重烫伤大鼠肝细胞焦亡的影响及其分子机制。

采用实验研究方法。将15只6~8周龄雌性SD大鼠按随机数字表法（分组方法下同）分为假伤组、单纯烫伤组、烫伤+肉碱组，每组5只，单纯烫伤组和烫伤+肉碱组大鼠背部制作30%体表总面积的Ⅲ度烫伤，其中烫伤+肉碱组大鼠另外给予腹腔注射左旋肉碱。伤后72 h，采用全自动生化仪检测肝损伤生物化学指标天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）水平，样本数为5。伤后72 h，采用苏木精-伊红染色观察肝组织损伤情况。伤后72 h，采用实时荧光定量反转录PCR（RT-qPCR）法检测肝组织中细胞焦亡相关标志物核苷酸结合寡聚化结构域蛋白样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）、胱天蛋白酶1（caspase-1）、消皮素D和白细胞介素1β（IL-1β）以及内质网应激相关标志物葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）的mRNA水平；采用蛋白质印迹法检测肝组织中GRP78、CHOP、NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白表达水平，样本数均为5。取人肝癌细胞HepG2，分为二甲基亚砜（DMSO）组、0.1 μmol/L衣霉素组、0.2 μmol/L衣霉素组、0.4 μmol/L衣霉素组、0.8 μmol/L衣霉素组，分别作相应处理。培养24 h后，采用细胞计数试剂盒8法检测细胞活力并筛选衣霉素干预浓度（样本数为5）。取HepG2人肝癌细胞，分为DMSO组、单纯衣霉素组和衣霉素+肉碱组，分别作相应处理。培养24 h后，采用蛋白质印迹法检测细胞中GRP78、CHOP、NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白表达水平，样本数均为3。对数据行单因素方差分析和LSD-t检验。

伤后72 h，单纯烫伤组大鼠血清中AST和ALT水平分别为（640±22）、（157±8）U/L，均分别明显高于假伤组的（106±13）、（42±6）U/L（t值分别为-46.78、-25.98，P<0.01）；烫伤+肉碱组大鼠血清中AST和ALT水平分别为（519±50）、（121±10）U/L，均明显低于单纯烫伤组（t值分别为4.93、6.06，P<0.01）。伤后72 h，假伤组大鼠肝组织形态基本正常，未见明显的炎症细胞浸润；与假伤组相比，单纯烫伤组大鼠肝组织可见大量的炎症细胞浸润，细胞排列紊乱；与单纯烫伤组相比，烫伤+肉碱组大鼠肝组织可见少量的炎症细胞浸润。伤后72 h，单纯烫伤组大鼠肝组织中NLRP3、caspase-1、消皮素D和IL-1β mRNA表达水平均明显高于假伤组（t值分别为34.42、41.93、30.17、15.68，P<0.01）；烫伤+肉碱组大鼠肝组织中NLRP3、caspase-1、消皮素D和IL-1β mRNA表达水平均明显低于单纯烫伤组（t值分别为34.40、37.20、19.95、7.88，P<0.01）。伤后72 h，与假伤组相比，单纯烫伤组大鼠肝组织中NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白表达水平均明显升高（t值分别为12.28、26.92、5.20、10.02、24.78，P<0.01）；与单纯烫伤组相比，烫伤+肉碱组大鼠肝组织中NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白表达水平均明显下降（t值分别为10.99、27.96、12.69、8.96、12.27，P<0.01）。伤后72 h，单纯烫伤组大鼠肝组织中GRP78、CHOP的mRNA水平均明显高于假伤组（t值分别为21.00、16.52，P<0.01），烫伤+肉碱组大鼠肝组织中GRP78、CHOP的mRNA水平均明显低于单纯烫伤组（t值分别为8.92、8.21，P<0.01）；单纯烫伤组大鼠肝组织中GRP78、CHOP的蛋白表达水平均明显高于假伤组（t值分别为22.50、14.29，P<0.01），烫伤+肉碱组大鼠肝组织中GRP78、CHOP的蛋白表达水平均明显低于单纯烫伤组（t值分别为14.29、5.33，P<0.01）。培养24 h后，与DMSO组相比，0.1 μmol/L衣霉素组、0.2 μmol/L衣霉素组、0.4 μmol/L衣霉素组、0.8 μmol/L衣霉素组细胞存活率均明显下降（t值分别为4.90、9.35、18.64、25.09，P<0.01）；选择0.8 μmol/L作为后续衣霉素的干预浓度。培养24 h后，与DMSO组相比，单纯衣霉素组细胞GRP78、CHOP的蛋白表达水平均明显升高（t值分别为10.48、17.67，P<0.01）；与单纯衣霉素组相比，衣霉素+肉碱组细胞GRP78、CHOP的蛋白表达水平均明显下降（t值分别为8.08、13.23，P<0.05或P<0.01）。培养24 h后，与DMSO组相比，单纯衣霉素组细胞NLRP3、消皮素D-N蛋白表达水平均明显升高（t值分别为13.44、27.51，P<0.01），caspase-1、caspase-1/p20、剪切型IL-1β蛋白表达水平均无明显变化（P>0.05）；与单纯衣霉素组相比，衣霉素+肉碱组细胞NLRP3、消皮素D-N蛋白表达水平均明显下降（t值分别为20.49、21.95，P<0.01），caspase-1、caspase-1/p20、剪切型IL-1β蛋白表达水平均无明显变化（P>0.05）。

在严重烫伤大鼠中，外源性左旋肉碱可能通过抑制过度内质网应激介导的细胞焦亡相关通路发挥对肝损伤的保护作用。