Optimization of Ultrasound-Assisted Enzyme Modification Process of Chlorella Protein and Analysis of Its Emulsification Properties
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摘要: 本文以小球藻蛋白为研究对象，探究了超声辅助酶改性条件优化及改性后乳化特性的变化。选择超声时间、超声功率、酶添加量、酶反应时间为考察因素，使用层次分析法对乳化活性、乳化稳定性和乳析指数分别赋予权重，并以综合加权得分为响应值，采用四因素三水平的响应面法探究超声辅助酶改性小球藻蛋白乳化特性的最佳改性条件。结果表明，最佳改性工艺条件为：超声时间31 min、超声功率209 W、酶添加量3.1%、酶反应时间3 h。在此优化条件下，乳化性能的最佳评分可以达到98.99，与预测值接近。同时，改性小球藻蛋白的溶解性和起泡性与原蛋白相比分别提高了68.30%和49.44%，但持水性和持油性的改善效果并不明显。综上，该研究为小球藻蛋白在食品乳化体系中的应用提供了一定的理论基础。Abstract: The optimized conditions of ultrasound-assisted enzyme modification and the effects of modification on the emulsification properties of Chlorella protein were investigated in this paper. The ultrasonic time, ultrasonic power, enzyme addition and enzyme reaction time were selected as the investigating factors. The analytic hierarchy process (AHP) was used to weight the emulsification activity, emulsification stability and creaming index, and the comprehensive weighted score was used as the response value. A four-factor, three-level response surface method was used to investigate the optimal modification conditions for the emulsification properties of ultrasound-assisted enzyme-modified Chlorella protein. The results showed that the optimal modification conditions were as follows: Ultrasonic time 31 min, ultrasonic power 209 W, enzyme addition 3.1% and enzyme reaction time 3 h. Under the optimized conditions, the best score of emulsification performance was 98.99, which was close to the predicted value. Compared with the original protein, the solubility and foaming ability of modified Chlorella protein increased by 68.30% and 49.44%, respectively. However, the modification of water-holding and oil-holding properties showed no significant effect. In summary, this study could provide certain theoretical basis for the application of Chlorella protein in food emulsification systems.
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小球藻（Chlorella）是一种生长在淡水中的球形单细胞微藻，它含有丰富的蛋白质、脂质、矿物质以及叶绿素、藻胆素、维生素等多种生物活性物质[1-3]。并且其干重中蛋白质含量超过50%，高于大豆、核桃等常见的蛋白质来源[4]。同时，小球藻蛋白的氨基酸组成与人体对必需氨基酸的需求相似，具有良好的营养特性与低过敏性[5]。此外，小球藻蛋白具有抗炎、抗菌、抗氧化等多种生物学益处，是一种很有前途的新型蛋白质资源[6]。然而，小球藻蛋白中含有近54%的不溶性蛋白，它们在水性体系中分散能力极差，导致其通常作为惰性填料使用，而非乳化剂、发泡剂等食品体系中的功能成分，极大地限制了小球藻蛋白在食品领域的应用[7]。因此，利用蛋白质修饰的方法，改善小球藻蛋白的功能特性，从而解决其局限性，使其成为食品系统的多功能成分是目前研究的热点[8]。
近年来，超声波技术因具有操作简单、过程易控制、作用时间短等优点在食品工业中得到了广泛的应用[9]。超声波是一种不涉及热处理的物理技术，通过机械作用和空化作用改变蛋白质的结构和组成，从而改善其功能特性，如溶解度、乳化性、发泡性等[10]。在O/W体系中，当超声波施加声源的压力幅度达到空化阈值时，其促使局部区域的水动力剪切增大和泡沫破裂部位的温度上升，调控蛋白质的聚集行为[11]。李杨等[12]采用超声波处理大豆蛋白，发现其溶解性和乳化性能得到了明显改善。酶法改性是最常用的改性方法，其最大的优点是不会导致蛋白质中营养成分损失，也很少产生毒理学方面的问题[13]。其中谷氨酰胺转氨酶（Transglutaminase，TG）是植物蛋白交联最常用的酶，它通过催化酰基转移，使蛋白质分子间或分子内的肽段之间形成共价键，从而使蛋白质分子间发生交联，因此在蛋白质改性方面有非常广泛的用途[8,14]。Yong等[15]研究发现在pH为7.0时用谷氨酰胺酶对小麦蛋白进行脱酰胺，明显提高蛋白的乳化性。薛雨菲等[16]研究了TG酶对核桃谷蛋白的影响，发现其乳化特性分别提高了31.81%、41.55%，起泡性提高了28.21%。目前，针对小球藻蛋白的国内外研究大多数侧重于提取方法的研究[17]，对其改性以及功能特性方面的研究鲜有报道且其改性方法较为单一。同时在乳化特性研究中，有时各乳化指标无法同时达到最佳，使乳化特性的综合判断存在一定难度，而层次分析法 （Analytic Hierarchy Process, AHP）是一种解决多目标的复杂问题的定性与定量相结合的决策分析方法[18]。因此，本研究以提高小球藻蛋白乳化性为目的，利用超声辅助酶的复合改性方法，通过层次分析法对小球藻蛋白乳化性进行评价，从而增强其结果的科学性及合理性。
为进一步得到最佳改性的工艺条件，本研究采用超声辅助TG酶处理小球藻蛋白，探究超声功率、超声时间、酶浓度、酶处理时间这四个因素对小球藻蛋白乳化特性的影响，以乳化特性的综合评分为响应值，采用响应面Box-Behnken法优化小球藻蛋白乳化特性的改性工艺条件参数，并对其功能特性进行一定的探究，为拓宽小球藻蛋白的应用范围提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
破壁蛋白核小球藻粉 纯度60.7%，青岛科海生物有限公司；谷氨酰胺转胺酶 2100 U/g，酷尔化学科技（北京）有限公司；食用大豆油 益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司；硫酸铵 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；透析袋 北京怡康盛世生物科技有限公司；十二烷基硫酸钠 分析纯，国药集团化学试剂北京有限公司；其余化学试剂 均为分析纯。
CP213电子分析天平 奥豪斯仪器（上海）有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 上海秋佐科学仪器有限公司；DL-5-B低速大容量多管离心机 上海安亭科学仪器厂；BILON96-Ⅱ超声波细胞粉碎机 上海比朗仪器有限公司；HHS-Ⅰ1-1电热水浴锅 上海一恒有限公司；FJ200-T高速均质乳化机 韬越上海机械科技有限公司；UV-2000紫外分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；便携式pH计 奥豪斯仪器（上海）有限公司；Scientz Z-10N真空冷冻干燥机 郑州科达机械仪器设备有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 小球藻蛋白的提取
参考胡守珍[19]的方法并稍作修改，通过盐析法提取小球藻蛋白。称取60 g破壁椭圆小球藻粉，溶于400 mL去离子水使其分散。在4 ℃下，缓慢加入硫酸铵，使溶液饱和度达到80%，在4 ℃下沉降30 min后以10000 r/min离心10 min，取沉淀。往离心管中加入少量去离子水，均匀分散沉淀并转移至7 kDa透析袋中，在4 ℃下透析24 h除盐。将得到的溶液冷冻干燥，即得小球藻蛋白。按照GB 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》测量得小球藻蛋白粉中蛋白质含量（70.7%±1.2%），按照GB 5009.6-2016《食品中脂肪的测定》测量得小球藻蛋白粉中脂肪含量（10.4%±0.5%），按照GB/T 15672-2009《食品菌中总糖含量的测定》测量得小球藻蛋白粉中可溶性糖含量（9.7%±0.3%），采用GB 5009.3-2016《食品中水分的测定》测得小球藻蛋白水分含量（2.2%±0.1%），采用GB 5009.4-2016《食品中灰分的测定》测得小球藻蛋白总灰分含量（7.2%±0.6%）。
1.2.2 小球藻蛋白的超声辅助酶改性工艺
称取一定量小球藻蛋白粉，过80目筛，随后将其配制成5 mg/mL的蛋白溶液，分别使用超声细胞破碎仪和谷氨酰胺转氨酶在一定条件下处理。超声时将蛋白溶液置于冰水浴中，超声温感探头浸入其中，监测蛋白溶液温度始终控制在35 ℃以下，并确保在超声过程中探头处于液面以下同一高度，设置超声功率和时间，超声处理程序设为处理2 s，停2 s[20]。酶处理时将蛋白溶液于50 ℃，pH为7.0的条件下反应一定时间。反应结束后，置于90 ℃水浴5 min灭酶[10]。处理完后均经过真空冷冻干燥得到改性小球藻蛋白粉。
1.2.3 单因素实验
以超声时间30 min，超声功率200 W，酶浓度3%，酶反应时间3 h为基础实验条件。考察超声时间（10、20、30、40、50 min）、超声功率（100、150、200、250、300 W）、酶浓度（1%、2%、3%、4%、5%）、酶反应时间（2、2.5、3、3.5、4 h）等因素对小球藻蛋白乳化特性的影响。
1.2.4 响应面试验
在单因素实验结果分析的基础上，基于Box-Behnken设计原理，选取超声时间（A）、超声功率（B）、酶浓度（C）和酶反应时间（D）四因素，采用三水平进行优化设计。小球藻蛋白乳化特性改性工艺因素水平如表1。
表 1 响应面试验因素水平表Table 1. Factors and levels for response surface test水平 因素 A超声时间（min） B超声功率（W） C酶浓度（%） D酶反应时间（h） −1 20 150 2 2.5 0 30 200 3 3.0 1 40 250 4 3.5 1.2.5 超声辅助酶改性对小球藻蛋白功能特性的影响
根据1.2.4的响应面试验得到的最佳改性工艺条件，随后在该条件下制备超声辅助TG酶改性小球藻蛋白，在此基础上探究超声辅助酶改性对小球藻蛋白功能特性的影响。
1.2.6 指标测定
参考Hui等[21]的方法并做一定调整。分别取24 mL 2 mg/mL的不同样品溶于磷酸盐缓冲液中（0.2 mol/L NaH2PO4/Na2HPO4，pH8.2），加入8 mL大豆油，使其充分混合。在10000 r/min均质剪切机下高速均质1 min。分别于（0、10 min）从溶液底部取样50 μL，用0.1% SDS溶液稀释100倍，随后立即测定500 nm处吸光度（A0，A10）。乳化活性指数与乳化稳定性指数计算如下：
$$ \text{乳化活性指数}\text{EAI}({\text{m}}^{\text{2}}\text{/g})\text=\frac{\text{2×2.303×DF×}{\text{A}}_{\text{0}}}{\text{C×}\varnothing \text{×}(1-\theta)\text{×10000}} $$ $$ \text{乳化稳定性指数}\text{ESI}({\rm{min}})\text=\frac{{\text{A}}_{\text{0}}}{{\text{A}}_{\text{0}}-{\text{A}}_{\text{10}}}\text{×10} $$ 式中，A0及A10为乳液在初始时刻和放置10 min后500 nm处吸光度值；DF为稀释倍数，DF=100；C为蛋白浓度，g/mL；
$ \mathrm{\varnothing } $ 为光程，$ \mathrm{\varnothing } $ =1 cm；θ为乳液中油相所占比例，θ=0.25。乳析指数的测定参考Shao等[22]的方法，略有改动。将不同条件处理后的蛋白冻干粉配制为5 mg/mL的蛋白溶液，加入体积分数为10%的大豆油作为油相，使其充分混合，在10000 r/min均质剪切机下高速均质1 min，得到乳液。取15 mL制备的乳液倒入密封的透明平底试管中，加入质量分数为0.04%叠氮化钠溶液为抗菌剂防止乳液腐败。在25 ℃恒温避光培养箱中放置两周后，测定析出乳清的高度（Hs）、油水混合液总高度（Ht）。乳析指数（CI）按下式计算：
$$ \text{CI(\%)=}\frac{{\text{H}}_{\text{s}}}{{\text{H}}_{\text{t}}}\text{×100} $$ 根据美国运筹学家Saaty提出的AHP理论[23]，采用1～9标度法对乳化活性指数、乳化稳定性和乳析指数3项指标两两对比，获取相对评分，计算各指标权重系数。
溶解性的测定参考孙乾[24]的方法，略有改动。分别称取0.10 g的超声辅助酶处理以及对照组的小球藻蛋白粉末分散于10 mL去离子水中，pH调为7.0，室温下磁力搅拌2 h使其充分溶解，溶液以4500 r/min离心15 min，采用考马斯亮蓝法测定上清液蛋白质含量。 溶解度计算公式如下：
$$ \text{溶解度}\left(\text{%}\right)\text=\frac{\text{上清液蛋白含量}}{\text{样品中蛋白含量}}\text{×100} $$ 持水性的测定根据Mn A[25]的方法，略有改动。称取0.10 g的超声辅助酶处理以及对照组的小球藻蛋白粉末置于离心管中，加入10 mL去离子水，室温下以200 r/min振荡2 h，使其充分水合。随后，以4500 r/min离心15 min，倒出水分，称取样品和离心管质量。
$$ \text{持水性}(\text{g/g})\text=\frac{{\text{M}}_{\text{2}}-{\text{M}}_{\text{1}}}{{\text{M}}_{\text{0}}} $$ 式中，M0是样品质量，g；M1是离心管与样品的总质量，g；M2是离心管与沉淀物的总质量，g。
根据Mn等[25]的方法并做一定调整。称取0.10 g的超声辅助酶处理以及对照组的小球藻蛋白粉末置于离心管中，加入5 mL大豆油，涡旋振荡1 min，以3300 r/min离心15 min。吸油纸吸去残留油脂，称取样品和离心管质量。
$$ \text{持油性}(\text{g/g})\text=\frac{{\text{M}}_{\text{2}}-{\text{M}}_{\text{1}}}{{\text{M}}_{\text{0}}} $$ 式中，M0是样品质量，g；M1是离心管与样品的总质量，g；M2是吸油后离心管与样品的总质量，g。
根据Agyare等[26]的方法并做一定调整。称取超声辅助酶处理以及对照组的样品溶解于磷酸缓冲液（0.2 mol/L NaH2PO4/Na2HPO4，pH7.0）中，使其浓度为1 mg/mL。取10 mL样品，在13000 r/min高速乳化均质2 min，测量总体积，30 min后再次测量总体积。起泡性与泡沫稳定性计算如下：
$$ \text{起泡性}(\text{FC})\text=\frac{{\text{V}}_{\text{0}}}{{\text{V}}_{\text{1}}}\text{×100\%} $$ $$ \text{泡沫稳定性}(\text{FS})\text=\frac{{\text{V}}_{\text{1}}}{{\text{V}}_{\text{2}}}\text{×100\%} $$ 式中，V0是初始样液体积，mL；V1是均质后放置 0 min 后样液总体积，mL；V2是均质后放置30 min后样液总体积，mL。
1.3 数据统计与分析
采用SPSS 25.0分析软件和Origin 8.0软件处理所得试验结果，数据均为3个平行样本，以平均值±标准差表示，并使用ANOVA程序进行显著性分析（P<0.05）。软件Design Expert 12进行响应面设计与方差分析。
2 结果与分析
2.1 AHP法确定各项指标的权重
由于小球藻蛋白的乳化特性是由多种指标共同评价，而乳化活性、乳化稳定性和乳析指数无法同时处于最佳值，因此根据其对乳化特性各方面的评价指标，将乳化活性指数、乳化稳定性指数和乳析指数作为权重指标予以量化，最终计算综合评分来判断其乳化特性。AHP理论分析法中的1～9标度法对各指标的相对评分标准如表2，因此如表3所示乳化活性相对于乳化稳定性同等重要，故记为1，乳化活性与乳化稳定性均相对于乳析指数明显重要，故均记为5/3，从而获得成对比较矩阵和按照几何平均法得到的权重系数列。
相对重要性 定义 1 同等重要 3 稍微重要 5 明显重要 7 强烈重要 9 绝对重要 2,4,6,8 以上相邻指标的中间值 倒数 若i与j的重要性之比为Aij，
则j与i的重要性之比为1/Aij表 3 3种指标的比较矩阵表Table 3. Decision matrix of paried comparison on three indexes指标 乳化
活性乳化
稳定性乳析
指数特征
向量权重值
（%）最大
特征值CI值 CR值 乳化活性 1 1 5/3 1.154 38.462 3.001 0.0005 0.0009 乳化稳定性 1 1 5/3 1.154 38.462 乳析指数 3/5 3/5 1 0.692 23.077 注：CI=（最大特征根−n）/（n−1）；CR=CI/RI。 由表3矩阵分析结果可得，乳化活性指数、乳化稳定性和乳析指数的权重系数分别为38.462%、38.462%、23.077%，一致性比列因子（CR）=0.0009<0.100，即指标优先比较判断矩阵具有满意的一致性，求得的权重系数有效，可用于乳化性评价的综合评分[23]。综合评分=（乳化活性指数/最高乳化活性指数）×38.462%+（乳化稳定性/最高乳化稳定性）×38.462%+（2-乳析指数/最低乳析指数）×23.077%。
2.2 单因素实验
2.2.1 超声时间对小球藻蛋白乳化特性的影响
如图1所示，在基础实验条件下，随着超声时间的增加，其乳化特性均出现显著性变化（P<0.05），综合得分经计算先增加后减小，当超声时间为30 min时，综合得分最大。这是由于超声通过空化效应产生的物理力，使乳液的粒径减小，从而进一步改善其乳化活性和乳化稳定性[27]。随着时间延长，蛋白分子包裹足够多油滴后，产生聚集甚至絮凝现象，从而降低乳化性能[28]，综合得分降低。故超声时间选择为30 min。
图 1 超声时间对小球藻蛋白乳化性能及其综合得分的影响Figure 1. Effects of ultrasonic time on the emulsifying property and comprehensive score of Chlorella protein2.2.2 超声功率对小球藻蛋白乳化特性的影响
如图2所示，在基础实验条件下，随着超声功率的增加，其乳化特性均出现显著性变化（P<0.05），综合得分经计算先增加后减小，当超声功率为200 W时，综合得分最大。这是因为超声的空化和机械效应破坏蛋白的四级结构，释放小分子的肽，从而包裹更多油滴，使其乳化性能增加[29]。随着功率的增加，小球藻蛋白暴露出更多的疏水性基团，疏水相互作用增强，产生不溶性小聚体进而降低乳化性能[27]，使综合得分降低。故超声功率选择为200 W。
图 2 超声功率对小球藻蛋白乳化性能及其综合得分的影响Figure 2. Effects of ultrasonic power on the emulsifying property and comprehensive score of Chlorella protein2.2.3 酶添加量对小球藻蛋白乳化特性的影响
如图3所示，在基础实验条件下，随着酶添加量的增加，其乳化特性出现显著性变化（P<0.05），经计算综合得分先增加后减小，在酶添加量与底物之比从1%增加至3%时，综合得分迅速升高，在3%时达到最大。这是可能是因为酶添加量增大，TG酶的脱酰胺作用使得蛋白质分子中的谷氨酰胺和天冬酰胺残基转化为谷氨酸和天冬氨酸，负电荷增加，从而增强了蛋白质的两亲性。同时，其水/油界面的小液滴促进了酶的作用，使得蛋白质表面张力降低，增加其与水结合的能力，赋予了蛋白质更高的乳化特性[30]。但当酶添加量继续增加，TG酶导致蛋白质分子过度交联化使其乳化特性降低[31]，从而导致综合评分减小。故酶添加量选择为3%。
图 3 酶添加量对小球藻蛋白乳化性能及其综合得分的影响Figure 3. Effects of enzyme addition on the emulsifying property and comprehensive score of Chlorella protein2.2.4 酶反应时间对小球藻蛋白乳化特性的影响
如图4所示，在基础实验条件下，随着酶反应时间的增加，其乳化特性出现显著性变化（P<0.05），综合得分经计算先增加后趋于平缓，在酶反应时间增加至3.0 h时，综合得分迅速升高且达到最大。这是因为TG酶的交联作用蛋白使得蛋白质分子量增大，提高了其包裹油滴的能力，从而增加蛋白的乳化性[32]。随着酶反应时间的增加，分子量增大到一定量，形成空间位阻，蛋白与蛋白之间聚集，发生絮凝沉降，造成乳化性下降[33]，从而综合评分减小。故酶反应时间选择为3.0 h。
图 4 酶反应时间对小球藻蛋白乳化性能及其综合得分的影响Figure 4. Effects of enzyme reaction time on the emulsifying property and comprehensive score of Chlorella protein2.3 Box-Behnken 响应面法优化超声辅助酶改性小球藻蛋白乳化特性工艺
2.3.1 Box-Behnken 响应面法优化工艺实验设计及结果
综合以上单因素实验结果，以综合得分为响应指标，采用Box-Behnken响应面法优化超声波辅助酶改性小球藻蛋白乳化特性工艺。对超声时间、超声功率、酶添加量和酶反应时间这四个因素设置三个不同的水平，得到如表4所示的29组设计方案（其中5组为中心点）。
表 4 响应面设计方案与结果Table 4. The design and results of response surface实验编号 A B C D EAI（m2/g） ESI（min） CI（%） 综合得分 1 −1 −1 0 0 25.77 109.22 25.55 75.13 2 1 −1 0 0 28.21 115.23 23.17 82.42 3 −1 1 0 0 29.54 111.74 22.73 83.29 4 1 1 0 0 30.13 115.49 20.97 87.20 5 0 0 −1 −1 24.88 112.78 24.72 76.30 6 0 0 1 −1 28.83 114.92 22.64 83.63 7 0 0 −1 1 26.06 112.69 22.42 80.32 8 0 0 1 1 28.86 114.17 20.28 85.42 9 −1 0 0 −1 26.33 116.78 22.49 81.76 10 1 0 0 −1 27.91 114.96 22.08 83.36 11 −1 0 0 1 28.64 111.49 22.02 83.14 12 1 0 0 1 30.19 113.96 19.81 88.22 13 0 −1 −1 0 24.72 110.34 25.52 74.72 14 0 1 −1 0 25.44 112.24 23.13 78.67 15 0 −1 1 0 27.90 113.02 23.98 80.44 16 0 1 1 0 30.69 116.74 20.13 89.19 17 −1 0 −1 0 25.55 112.98 25.76 75.79 18 1 0 −1 0 28.43 114.77 23.77 81.78 19 −1 0 1 0 29.16 115.34 22.15 84.70 20 1 0 1 0 27.02 117.01 20.13 85.44 21 0 −1 0 −1 26.83 109.77 25.65 76.28 22 0 1 0 −1 29.73 111.84 22.43 83.88 23 0 −1 0 1 24.12 110.77 19.97 80.70 24 0 1 0 1 29.07 112.67 19.85 86.60 25 0 0 0 0 36.79 121.82 19.18 98.28 26 0 0 0 0 35.62 126.22 19.56 97.93 27 0 0 0 0 36.15 125.71 19.03 98.97 28 0 0 0 0 35.08 125.13 18.87 97.88 29 0 0 0 0 35.27 124.98 19.14 97.70 2.3.2 方差分析
表4中的实验数据采用 Design Expert 12软件分析，对超声时间、超声功率、酶添加量和酶反应时间4个小球藻蛋白乳化性的影响因素回归拟合，其最终乳化性的综合得分=98.15+2.05A+3.26B+3.44C+1.60D−0.8450AB−1.31AC+0.8700AD+1.2BC−0.4250BD−0.5575CD−7.06A2−8.78B2−9.04C2−7.39D2。对小球藻蛋白乳化性实验模型进行方差分析，结果如表5。回归模型P<0.0001，表明回归模型极为显著，失拟项P=0.1356>0.05，说明失拟项不显著，实验结果受其他因素的干扰小，模型充分反映了响应值和各参数之间的关系。模型决定系数（R2）和校正决定系数（R2Adj）分别为0.9937和0.9874，二者相近，且均大于0.9，说明小球藻蛋白乳化性的最佳实验条件下的实验值和预测值具有较好的相关性； 模型拟合精密度为39.7870，远大于4，也表明该模型对小球藻蛋白乳化性综合得分的预测具有重要意义。另外，低变异系数（CV）为0.9609%<10% ，说明拟合程度好，实验的精确度和可信度高，因此可用此模型对优化小球藻蛋白的乳化性进行预测和分析。回归模型中的4个一次项（A、B、C和D）和4个二次项（A2、B2、C2和D2）均呈极显著影响（P<0.0001），交互项（AC、BC）呈显著影响（P<0.05）。从F值可知，4个因素对小球藻蛋白乳化性的影响大小依次为：C（酶添加量）>B（超声功率）>A（超声时间）>D（酶反应时间）。
表 5 响应面方差分析Table 5. Variance analysis of response surface方差来源 平方和 自由度 均方 F P 显著性 模型 1472.82 14 105.13 158.33 <0.0001 ** A-超声时间 50.47 1 50.47 76.01 <0.0001 ** B-超声功率 127.66 1 127.66 192.26 <0.0001 ** C-酶添加量 141.73 1 141.73 213.44 <0.0001 ** D-酶反应时间 30.69 1 30.69 46.22 <0.0001 ** AB 2.86 1 2.86 4.30 0.0570 AC 6.89 1 6.89 10.38 0.0062 * AD 3.03 1 3.03 4.56 0.0509 BC 5.76 1 5.76 8.67 0.0106 * BD 0.72 1 0.72 1.09 0.3146 CD 1.24 1 1.24 1.87 0.1928 A2 323.59 1 323.59 487.33 <0.0001 ** B2 499.67 1 499.67 752.51 <0.0001 ** C2 530.30 1 530.30 798.64 <0.0001 ** D2 354.30 1 354.30 533.58 <0.0001 ** 残差 9.30 14 0.67 失拟项 8.28 10 0.83 3.27 0.1356 纯误差 1.01 4 0.25 总误差 1481.12 28 R2=0.9937 R2Adj=0.9874 CV（%）=0.9609 Adequate Precision：39.7870 注：**为P<0.0001，差异极显著；*为P<0.05，差异显著。 2.3.3 交互作用的分析及验证实验
各因素之间的交互作用如图5所示，因素对响应值影响越显著，响应面图曲面越陡峭[34]。酶添加量与超声功率对其乳化特性的影响曲线较陡，说明这两个交互作用显著，而超声时间与酶反应时间的影响曲线较为平滑，说明影响不显著。根据软件计算结果，得到小球藻蛋白乳化性能的最佳改性工艺为超声时间31.257 min、超声功率209.408 W、酶添加量3.156%、酶反应时间3.04 h。在此条件下，预测乳化性能的综合评分为98.98。考虑实际操作可行性，进行验证时将优化条件修正为超声时间31 min、超声功率209 W、酶添加量3.2%，酶反应时间3 h。进行3次重复试验验证预测结果，结果表明在该条件下其乳化活性指数为36.17 m2/g，乳化稳定性为125.72 min，乳析指数为19.04%，其乳化性能的综合评分为98.99，与预测值接近，表明具有可行性。
图 5 各因素交互作用对小球藻蛋白乳化特性影响的响应面图Figure 5. Response surface diagram of the interaction of various factors on the emulsifying characteristics of Chlorella protein2.4 超声辅助酶改性对小球藻蛋白功能特性的影响
根据响应面优化得到的最佳工艺条件（超声时间31 min、超声功率209 W、酶添加量3.2%，酶反应时间3 h）制备改性小球藻蛋白，在此基础上探究超声辅助酶改性对小球藻蛋白功能特性的影响。
由表6可知，小球藻蛋白的溶解性和起泡性都在超声辅助酶改性的条件下明显增加。这是由于在超声过程中，空穴效应产生的空穴气泡，随着声波持续作用，气泡破裂产生能量差，进而促使原本不溶性蛋白转变成可溶性蛋白，增加可溶性蛋白含量，从而提高溶解性[28,35-36]。而在超声处理中蛋白构象展开，其亲水基团暴露于表面的同时也在释放疏水基团[37]，且TG酶也相应发生脱酰胺化[38]，因此其持水性增加但效果并不明显。此外，TG酶的催化作用会导致蛋白质二级和三级结构发生变化，随着肽链的舒展，更多的疏水区域的暴露会直接增加蛋白的持油性，但提高幅度不大[39]，这与薛雨菲等[16]研究结论相似。同时，超声波空化效应和剪切效应使蛋白质尺寸减小空气-水界面的吸附增加，使蛋白质颗粒均匀地分布在泡沫中，从而促进起泡性增加，而泡沫稳定性的减少主要是由于分子间内聚性和弹性的丧失[40]。
表 6 超声辅助酶改性对小球藻蛋白功能特性的影响Table 6. Effect of ultrasound assisted enzymatic modification on the functional properties of Chlorella protein样品 溶解性（%） 持水性（g·g−1） 持油性（g·g−1） 起泡性（%） 泡沫稳定性（%） 小球藻蛋白 32.75±1.83 1.51±0.03 3.11±0.03 45.83±1.45 133.33±3.98 改性小球藻蛋白 55.12±2.47 1.74±0.01 3.42±0.04 68.49±3.01 120.97±2.66 注：以上经t检验均在P<0.05水平上差异显著。 3 结论
本文以小球藻蛋白为原料，探究超声辅助TG酶对其乳化性能的影响。以超声时间、超声功率、酶添加量以及酶反应时间为单因素，以小球藻蛋白乳化指标的综合得分为响应值，采用Box-Behnken响应面法对小球藻蛋白乳化性的改性工艺进行优化，最佳改性工艺条件为：超声时间31 min、超声功率209 W、酶添加量3.1%、酶反应时间3 h，且这四个因素均对小球藻蛋白的乳化性有显著影响。并在此工艺条件下，其乳化活性指数为36.17 m2/g，乳化稳定性为125.72 min，乳析指数为19.04%，乳化性能的最佳评分可以达到98.99，且其实际值与预测值无明显差异。同时该改性工艺也有效地提高了小球藻蛋白溶解性与起泡性，但持水性与持油性提高并不明显。本研究提供了一种提高小球藻蛋白乳化特性的工艺条件，为食品乳化体系中更广泛的开发利用小球藻蛋白提供了科学依据。但本研究仅对小球藻蛋白的乳化特性及一些基础的功能特性进行了探讨，该法对小球藻蛋白其他性质的影响以及小球藻蛋白结构与其功能特性之间的关系尚待更进一步的研究。
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图 1 超声时间对小球藻蛋白乳化性能及其综合得分的影响
Figure 1. Effects of ultrasonic time on the emulsifying property and comprehensive score of Chlorella protein
图 2 超声功率对小球藻蛋白乳化性能及其综合得分的影响
Figure 2. Effects of ultrasonic power on the emulsifying property and comprehensive score of Chlorella protein
图 3 酶添加量对小球藻蛋白乳化性能及其综合得分的影响
Figure 3. Effects of enzyme addition on the emulsifying property and comprehensive score of Chlorella protein
图 4 酶反应时间对小球藻蛋白乳化性能及其综合得分的影响
Figure 4. Effects of enzyme reaction time on the emulsifying property and comprehensive score of Chlorella protein
图 5 各因素交互作用对小球藻蛋白乳化特性影响的响应面图
Figure 5. Response surface diagram of the interaction of various factors on the emulsifying characteristics of Chlorella protein
表 1 响应面试验因素水平表
Table 1. Factors and levels for response surface test
水平 因素 A超声时间（min） B超声功率（W） C酶浓度（%） D酶反应时间（h） −1 20 150 2 2.5 0 30 200 3 3.0 1 40 250 4 3.5 
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相对重要性 定义 1 同等重要 3 稍微重要 5 明显重要 7 强烈重要 9 绝对重要 2,4,6,8 以上相邻指标的中间值 倒数 若i与j的重要性之比为Aij，
则j与i的重要性之比为1/Aij
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表 3 3种指标的比较矩阵表
Table 3. Decision matrix of paried comparison on three indexes
指标 乳化
活性乳化
稳定性乳析
指数特征
向量权重值
（%）最大
特征值CI值 CR值 乳化活性 1 1 5/3 1.154 38.462 3.001 0.0005 0.0009 乳化稳定性 1 1 5/3 1.154 38.462 乳析指数 3/5 3/5 1 0.692 23.077 注：CI=（最大特征根−n）/（n−1）；CR=CI/RI。
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表 4 响应面设计方案与结果
Table 4. The design and results of response surface
实验编号 A B C D EAI（m2/g） ESI（min） CI（%） 综合得分 1 −1 −1 0 0 25.77 109.22 25.55 75.13 2 1 −1 0 0 28.21 115.23 23.17 82.42 3 −1 1 0 0 29.54 111.74 22.73 83.29 4 1 1 0 0 30.13 115.49 20.97 87.20 5 0 0 −1 −1 24.88 112.78 24.72 76.30 6 0 0 1 −1 28.83 114.92 22.64 83.63 7 0 0 −1 1 26.06 112.69 22.42 80.32 8 0 0 1 1 28.86 114.17 20.28 85.42 9 −1 0 0 −1 26.33 116.78 22.49 81.76 10 1 0 0 −1 27.91 114.96 22.08 83.36 11 −1 0 0 1 28.64 111.49 22.02 83.14 12 1 0 0 1 30.19 113.96 19.81 88.22 13 0 −1 −1 0 24.72 110.34 25.52 74.72 14 0 1 −1 0 25.44 112.24 23.13 78.67 15 0 −1 1 0 27.90 113.02 23.98 80.44 16 0 1 1 0 30.69 116.74 20.13 89.19 17 −1 0 −1 0 25.55 112.98 25.76 75.79 18 1 0 −1 0 28.43 114.77 23.77 81.78 19 −1 0 1 0 29.16 115.34 22.15 84.70 20 1 0 1 0 27.02 117.01 20.13 85.44 21 0 −1 0 −1 26.83 109.77 25.65 76.28 22 0 1 0 −1 29.73 111.84 22.43 83.88 23 0 −1 0 1 24.12 110.77 19.97 80.70 24 0 1 0 1 29.07 112.67 19.85 86.60 25 0 0 0 0 36.79 121.82 19.18 98.28 26 0 0 0 0 35.62 126.22 19.56 97.93 27 0 0 0 0 36.15 125.71 19.03 98.97 28 0 0 0 0 35.08 125.13 18.87 97.88 29 0 0 0 0 35.27 124.98 19.14 97.70
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表 5 响应面方差分析
Table 5. Variance analysis of response surface
方差来源 平方和 自由度 均方 F P 显著性 模型 1472.82 14 105.13 158.33 <0.0001 ** A-超声时间 50.47 1 50.47 76.01 <0.0001 ** B-超声功率 127.66 1 127.66 192.26 <0.0001 ** C-酶添加量 141.73 1 141.73 213.44 <0.0001 ** D-酶反应时间 30.69 1 30.69 46.22 <0.0001 ** AB 2.86 1 2.86 4.30 0.0570 AC 6.89 1 6.89 10.38 0.0062 * AD 3.03 1 3.03 4.56 0.0509 BC 5.76 1 5.76 8.67 0.0106 * BD 0.72 1 0.72 1.09 0.3146 CD 1.24 1 1.24 1.87 0.1928 A2 323.59 1 323.59 487.33 <0.0001 ** B2 499.67 1 499.67 752.51 <0.0001 ** C2 530.30 1 530.30 798.64 <0.0001 ** D2 354.30 1 354.30 533.58 <0.0001 ** 残差 9.30 14 0.67 失拟项 8.28 10 0.83 3.27 0.1356 纯误差 1.01 4 0.25 总误差 1481.12 28 R2=0.9937 R2Adj=0.9874 CV（%）=0.9609 Adequate Precision：39.7870 注：**为P<0.0001，差异极显著；*为P<0.05，差异显著。
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表 6 超声辅助酶改性对小球藻蛋白功能特性的影响
Table 6. Effect of ultrasound assisted enzymatic modification on the functional properties of Chlorella protein
样品 溶解性（%） 持水性（g·g−1） 持油性（g·g−1） 起泡性（%） 泡沫稳定性（%） 小球藻蛋白 32.75±1.83 1.51±0.03 3.11±0.03 45.83±1.45 133.33±3.98 改性小球藻蛋白 55.12±2.47 1.74±0.01 3.42±0.04 68.49±3.01 120.97±2.66 注：以上经t检验均在P<0.05水平上差异显著。
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