Effects of Temperature on the Quality of Procambarus clarkii during Waterless Preservation
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摘要: 为探究无水贮藏温度对克氏原螯虾保活期间品质的影响，本文分析了不同无水贮藏温度下克氏原螯虾保活期间存活率、肌肉品质、生理指标的变化。结果显示，无水贮藏72 h时，4~16 ℃组的克氏原螯虾的存活率仍有80%~90%；24 ℃组降至40%；32 ℃组为0。虾尾肌肉的水分含量、持水率、硬度和弹性随着贮藏温度的升高与贮藏时间的延长显著下降（P<0.05），乳酸的生成降低了肌肉的pH。4、24与32 ℃组超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、总抗氧化能力（T-AOC）酶活力及丙二醛（MDA）含量随着贮藏时间的延长显著升高（P<0.05），8~16 ℃组的氧化应激响应较低于4、24和32 ℃组。酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）以及溶菌酶（LZM）活性在4、24与32 ℃贮藏条件下显著升高（P<0.05），8~16 ℃组的变化相对平稳。研究表明，无水贮藏中保持适当低温条件，在12~16 ℃范围内，可提高克氏原螯虾存活率和肌肉品质，这与机体保持较低的氧化应激水平及维持良好的免疫机制有关，本实验结果可为克氏原螯虾无水贮运提供理论依据。Abstract: In order to investigate the effects of temperature on the quality of Procambarus clarkiii during waterless preservation, the changes in survival rates, muscle flesh quality, and physiological indicators of Procambarus clarkiii were analyzed under different waterless storage temperatures. The results showed that the survival rates of Procambarus clarkii in those of 4~16 ℃ groups were 80%~90% after 72 h of waterless preservation, the 24 ℃ group dropped to 40%, and the 32 °C group had reached zero. The moisture content, water-holding capacity, muscle hardness, and elasticity of muscle decreased significantly with the increase in temperature and time (P<0.05). The muscle pH was decreased by the production of lactic acid. The activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), total antioxidant capacity (T-AOC), and malondialdehyde (MDA) content in 4, 24 and 32 ℃ groups were increased significantly with the extension of storage time (P<0.05), the oxidative stress response value of 8~16 ℃ groups was lower than those of 4, 24 and 32 ℃ groups. The activities of acid phosphatase (ACP), alkaline phosphatase (AKP), and lysozyme (LZM) were increased significantly in 4, 24, and 32 ℃ groups (P<0.05), and the changes were relatively stable in those of 8~16 ℃ groups. The results indicated that the survival rates and muscle quality of Procambarus clarkii might be improved by keeping the appropriate low temperature in the range of 12~16 ℃ during waterless preservation, which was related to the maintenance of low oxidative stress levels and good immune mechanisms. The results would provide a theoretical basis for the waterless storage and transportation of Procambarus clarkiii.
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Key words:
- Procambarus clarkii /
- waterless preservation /
- temperature /
- texture /
- physiological indicators
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克氏原螯虾（Procambarus clarkii），常用名为小龙虾，于20世纪30年代由日本传入我国江苏，因其营养丰富、味道鲜美、风味独特，近年来备受消费者青睐。近年来，小龙虾养殖业蓬勃发展，2021年，我国小龙虾养殖面积2600万亩、产量263.36万吨，同比增长分别为19.01%和10.02%，克氏原螯虾已成为我国一大经济淡水养殖水产品，位列我国淡水养殖品种第6位[1]。随着鲜活小龙虾销售区域的扩大，面临着小龙虾从产地到加工销售地之间长途、长时运输时如何提高其保活保鲜周期的技术难题。克氏原螯虾为高蛋白高水分的动物，在离开养殖水域后，活体会受贮运过程中温度、水分含量、振动等因素的影响。这些因素会对机体造成影响，引起机体代谢紊乱[2]，不适合的运输条件下，虾死亡率升高，经济效益下降。
通常鲜活水产品采用的有水运输方法，需要大量的水来保持水产品的活力，这大大增加了货物重量并降低了装载能力。与此相反，无水运输则可以降低运输成本。但水生生物需要通过鳃吸收过滤水中的氧气达到呼吸的目的，无水环境下，会出现体表干燥、呼吸代谢异常的情况，影响其存活性。Lu等[3]在研究低温对梭子蟹无水运输胁迫时发现，温度达到12 ℃左右时，蟹的身体代谢等维持在一个稳定的水平，存活率在无水运输后有效提高。陈水春等[4]在研究三种不同龙虾的低温无水保活运输技术时，当龙虾的休眠与包装温度为12 ℃的情况下，模拟运输26 h后龙虾的平均存活率仍高于95%，若能掌握其生存温度，给予适当的贮藏条件，就能有效延长运输中的存活率。
温度是影响虾类生理生化反应的重要因素，过高或过低的温度会引发虾类机体应激反应，使其体内代谢失衡，影响其免疫功能，严重则引起死亡[5]。高温条件下对鳌虾类的生存、摄食、生长、繁殖以及抗逆性有所影响，影响其代谢免疫以及虾肉肉质等[6-7]。而低温条件下可降低水产动物新陈代谢速率，达到休眠或半休眠状态，在冷适应期间，水产动物通过改变代谢酶活性水平和细胞膜的磷脂组成来适应低温[8-9]，克氏原螯虾的鲜活产品保活运输采用的多为无水运输低温无水条件下进行运输需考虑环境因素对虾类的存活率、氧化应激、新陈代谢以及品质变化等[10-11]。目前，针对无水贮运过程中环境因素对其运输过程中机体应激响应的研究较少。因此，本文研究不同无水贮藏温度处理下，克氏原螯虾保活期的存活情况、肌肉品质及其生理生化变化，确定克氏原螯虾无水贮藏的适宜环境温度，以期提高其无水保活保鲜周期。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
克氏原螯虾 25±2.5 g，南宁市上林珠玥农业有限公司上林县三里镇基地，快速运输至广西大学轻工与食品工程学院后，利用周转箱暂养24 h，暂养时选用除氯自来水不断流动，连续曝气。暂养后选取健康、活力好、无断螯的个体进行实验。超氧化物歧化酶（SOD，批号SOD-1-W）、过氧化氢酶（CAT，批号CAT-1-W）、总抗氧化能力（T-AOC，批号TAOC-1-G）、丙二醛（MDA，批号MDA-1-Y）、可溶性蛋白（BCA，批号BCAP-1-W）试剂盒 苏州科铭生物有限责任公司；溶菌酶（LZM，批号A050-1-1）、酸性磷酸酶（ACP，批号A060-1-1）、碱性磷酸酶（AKP，批号A059-2-2）、乳酸（LD，批号A019-2-1）试剂盒 南京建成生物工程研究所。
RH-150L人工气候箱 郑州生元仪器有限公司；5418R高速冷冻离心机 德国艾本德股份公司；MR20-025V-1核磁共振成像分析仪 上海纽迈科技有限公司；TMS-PRO质构仪 美国FTC公司；Infinite M200 PRO光栅型多功能微孔板检测仪 奥地利TECAN公司；PHC-3E pH计 上海佑科仪器仪表有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 实验设计
经过暂养的虾，先于室温条件下的水中进行梯度降温，降温速率为5 ℃/h，将需要不同温度的克氏原螯虾经过梯度降温处理后进行分装，置于泡沫箱（52 cm×40 cm×40 cm）中，每箱50尾，每个温度3组平行。根据前期休眠临界温度的测定，将装载有虾的泡沫箱体转移至设定好温度4、8、12、16、24、32 ℃，湿度设定为90%±5% RH的人工气候箱中进行无水保活实验。
1.2.2 样品处理
存活率的取样时间点为0、24、48、72、96、120 h，其余指标取样时间点为0、24、48、72 h。取鲜活克氏原螯虾，迅速分离虾头与虾尾，使用消毒后的手术剪去虾壳与虾线，将完整的虾尾肉收集，一部分装入自封袋存于−80 ℃冰箱进行保存，用于肌肉乳酸含量与pH的测定，另一部分用于质构、持水率、水分的测定。肝胰脏采集后使用生理盐水冲洗，分装后于−80 ℃冰箱保存，用于生理生化中抗氧化酶、非特异性免疫酶的测定[6]。
1.2.3 指标测定
经过不同温度贮藏的克氏原螯虾，在取样点观察其行为特征（经过刺激能正常爬行，泳足可正常活动的为存活克氏原螯虾）。
$$ \mathrm{存}\mathrm{活}\mathrm{率}\left(\text{%}\right)=\frac{\mathrm{存}\mathrm{活}\mathrm{虾}\mathrm{尾}\mathrm{数}}{\mathrm{初}\mathrm{始}\mathrm{总}\mathrm{尾}\mathrm{数}}\times 100 $$ 参照GB 5009.3-2016食品中水分含量的测定的第一法：直接干燥法[12]。
利用MRI核磁共振成像软件设置成像，参数：利用多层自旋回波（SE）序列对虾肉进行磁共振成像，参数设置：层数3，视野80 mm×80 mm，层厚7.0 mm，层间隙1.0 mm，扫描次数4 次，累加次数16，回波时间18.125 ms，重复等待时间300 ms，图像均以Dicom格式保存并进行图像处理。
肌肉水分分布参照Zhang等[13]和Lan等[14]的方法稍作修改。将虾尾肌肉切成2.0 cm×2.0 cm×1.0 cm的小块，样本包裹一层保鲜膜并塞入LF-NMR低场核磁共振仪的分析管中，磁体温度32 ℃，射频线圈直径为1～25 mm，低场核磁共振的中心频率为22.00 MHz，自动寻找90°和180°脉冲宽度。将CPMG序列参数设置：重复采样等待时间Tw为4000 ms，回波个数NECH为10000，回波间隔TE为0.5 ms，重复扫描次数NS为4，从每个样本的3次重复扫描中获取10000次回波数据。
肌肉持水率参照Wang等[15]的方法稍作修改。取虾尾肌肉3.00 g，记录为m1，用滤纸包裹样品，放入离心管，6000 r/min离心10 min，离心后称取样品质量m2。
$$ \mathrm{持}\mathrm{水}\mathrm{率}\left(\text{%}\right)=\frac{{\mathrm{m}}_{2}}{{\rm m}_{1}}\times 100 $$ 蒸煮损失率参照孙存鑫等[16]的方法稍作修改，剥离肌肉并吸干表面水分，称量记录m3后，于烧杯中隔水加热15 min，温度恒温保持在90 ℃，取出吸干表面水分且称重m4。
$$ \mathrm{蒸}\mathrm{煮}\mathrm{损}\mathrm{失}\mathrm{率}\left(\text{%}\right)=\frac{{\mathrm{m}}_{3}-{\mathrm{m}}_{4}}{{\mathrm{m}}_{3}}\times 100 $$ 虾肉质地剖面分析参照米红波等[10]的方法稍作修改。将存活的虾剥壳，取完整的尾部肌肉，选取重量3.00g的肌肉进行测量。参数设置：采用P/40探头进行两次压缩，测试速度为60 mm/min，触发力为0.5 N，压缩形变为50%，两次压缩之间停顿时间为3 s。
pH参照Sharifian等[17]的方法稍作修改，精确称量2.00 g虾肉，加入10 mL蒸馏水，利用均质机匀浆1 min，匀浆后于室温条件下静置10 min，利用pH计电极直接浸入匀浆中，读取pH。
乳酸（LD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）、可溶性蛋白（BCA）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LZM）的测定严格按试剂盒说明书进行。
1.3 数据处理
所有数据均用平均±标准偏差（Mean±SD），每个时间点取三组平行。处理采用SPSS 26.0中的单因素方差分析和Duncan的多量程测试进行评估。绘图工具采用Origin 2022。
2 结果与分析
2.1 无水贮藏温度对克氏原螯虾保活期存活率的影响
存活率直观反映了克氏原螯虾在无水低温条件的耐受性，耐受性越差，存活率越低。无水贮藏温度对克氏原螯虾保活期存活率的影响如图1所示，24 h时，4~24 ℃温度处理组的虾存活率并无显著性差异（P>0.05），均在95%以上，32 ℃组存活率降至50%以下。48 h后，4~12 ℃贮藏的虾存活率在90%以上，但24 ℃组存活率降至80%左右，32 ℃组存活率降至20%左右。72 h时，4~12 ℃的虾存活率仍在90%以上，但16 ℃组存活率降至85%以下，24 ℃组存活率降至40%以下，32 ℃组已无存活。无水保活至120 h，4~12 ℃组的虾存活率仍在80%以上，其中12 ℃存活率最高，达到90%以上，16 ℃组存活率在60%~70%，24~32 ℃组存活率为0。
综上，在无水环境下，随着贮藏时间延长，6个温度处理组的虾存活率均呈下降趋势，总体上，4~16 ℃的低温环境下，克氏原螯虾的耐受能力较强，存活率相对较高。常温条件下，前24 h有一定的耐受程度，而经过长时间的干露胁迫，存活率明显下降，长时间的高温与无水胁迫下，克氏原螯虾机体耐受能力明显下降。
2.2 无水贮藏温度对克氏原螯虾保活期肌肉水分的影响
2.2.1 水分含量变化
无水贮藏温度对克氏原螯虾保活期肌肉的水分含量影响如表1所示。不同贮藏温度组，水分含量均随着贮藏时间延长而出现水分损耗，水分含量下降。其中，32 ℃下降最为严重，从83.80%下降至75.82%；24 ℃组肌肉水分含量小幅度下降；4~16 ℃四个处理组肌肉水分含量在同一贮藏时间内差异不显著（P<0.05）。
表 1 克氏原螯虾肌肉水分含量的变化（%）Table 1. Changes of muscle moisture content of Procambarus clarkii (%)组别（℃） 无水贮藏时间（h） 0 24 48 72 4 83.80±0.98Aa 81.32±0.47ABb 81.18±0.78ABb 80.13±1.63Ab 8 83.80±0.98Aa 82.43±0.30Aab 81.22±1.34ABbc 80.01±0.93Ac 12 83.80±0.98Aa 82.78±0.24Aab 82.33±0.55Ab 81.18±0.39Ac 16 83.80±0.98Aa 81.77±0.56ABb 81.36±1.11ABb 81.27±1.00Ab 24 83.80±0.98Aa 80.69±1.47BCb 80.12±0.35Bb 79.74±0.60Ab 32 83.80±0.98Aa 79.47±1.04Cb 75.82±1.20Cc − 注：同列不同大写字母代表同一贮藏时间下不同温度样品间差异显著（P<0.05）；同行不同小写字母代表同一温度下不同时间样品间差异显著（P<0.05）；表1~表3同。 2.2.2 水分分布变化
低场核磁共振（LF-NMR）可用于分析样品的水分迁移，通过1H质子密度图像的共振成像技术（MRI），可以直观反映克氏原螯虾贮藏过程的水分变化。1H质子密度越大，颜色越红亮，反之，水分减少，1H质子密度越小，红色亮点减少[15]。不同无水贮藏温度下克氏原螯虾的肌肉1H质子密度图图像变化如图2A所示，新鲜样品的红色斑点在样品中均匀分布，水分含量较高。随着贮藏时间的延长，样品的红色斑点从边缘逐渐消退，说明克氏原螯虾肌肉水分从表面不断蒸发，水分含量下降。其中。32 ℃虾尾与其他温度的差异较大，表明其水分损失严重。
图 2 克氏原螯虾肌肉伪彩图（A）与横向弛豫图（B）的变化Figure 2. Changes of pseudo color map (A) and transverse relaxation spectra (B) of Procambarus clarkii muscle利用低场核磁共振的弛豫时间T2可表征克氏原螯虾中的水分结合状态及其变化，不同处理导致肉样中水分子与大分子的结合发生变化[18]，弛豫时间越长，被测物中的水与底物的结合越松散[19]。T21（0~10 ms）代表与蛋白质紧密结合的结合水，T22（10~100 ms）代表位于高度组织化的蛋白质结构中的细胞内水，为不易流动水。T23（100~1000 ms）表示容易流失的自由水[20]。由图2B可见，新鲜的克氏原螯虾的T22信号强度最大，随着贮藏时间的延长，T22信号强度逐渐降低，其中8~16 ℃组的T22信号强度下降幅度最小，32 ℃组的下降幅度最大，说明32 ℃贮藏温度组的不易流动水含量下降较明显，4 ℃与24 ℃组的下降幅度介于8~16 ℃与32 ℃之间，8~16 ℃组则水分保持稳定。
LF-NMR中，T22信号强度的变化与MRI图像变化一致。LF-NMR水分迁移变化与水分含量测定的结果一致。由此表明，贮藏温度过高不利于克氏原螯虾水分的保持，导致水分的快速流失。32 ℃组的克氏原螯虾的存活率最低，这与其水分的快速流失存在密切联系。克氏原螯虾作为以鳃呼吸的动物，通过虾鳃过滤水中的氧气进行呼吸。在缺水的环境中，克氏原螯虾虽有一定的耐干露能力，能充分利用鳃中暂时储存的水分维持呼吸状态，但在水分消耗尽后，会出现呼吸困难和代谢缓慢等问题，引起机体内供养不足，逐渐发生死亡。高温不仅加速体表及鳃的水分蒸发，也使得体内代谢活力代谢旺盛，进而加快体内的营养消耗，从而造成肌肉的损耗，机体代谢紊乱出现死亡。
2.3 无水贮藏温度对克氏原螯虾保活期肌肉肉质的影响
2.3.1 克氏原螯虾持水率与蒸煮损失率的变化
持水率和蒸煮损失率表示肌肉的保水能力，持水力越高蒸煮损失率越低[21]。无水贮藏温度对克氏原螯虾保活期肌肉的持水率与蒸煮损失率如表2所示，新鲜肌肉的持水率为90.38%，蒸煮损失率在17%左右。随着贮藏时间的延长，克氏原螯虾各贮藏温度组呈现持水率下降，蒸煮损失率上升的趋势。不同的贮藏温度，其变化幅度有所差异，其中，贮藏温度越高（24~32 ℃），或贮藏温度越低（4~8 ℃），持水率下降越大，蒸煮损失率上升越明显，这可能是因为过高或过低的温度胁迫，肌肉的肌原纤维蛋白发生氧化，蛋白的疏水性增强，肌肉中的固定水转化为自由水，同时虾肉肌间结缔组织发生水解，肌间纤维之间的间隙增大，导致肌肉保水能力下降[22]。32 ℃贮藏48 h时，持水率下降至82.66%，蒸煮损失率已高达34.03%。6个贮藏温度组中，16 ℃的肌肉持水率下降最少，仍有85.11%，蒸煮损失率仍在24.48%，虾尾肌肉的保水性最佳，这与2.2中，贮藏温度对其水分含量的影响结果一致。持水力是机体组织通过物理方式截留水的能力，肌肉蛋白的网状结构决定其持水能力[23]，本研究中虾肌肉的持水率随着贮藏时间而下降，蒸煮损失率上升，这可能是由于长时间的温度胁迫和无水胁迫诱导了肌肉蛋白变性，肌原纤维蛋白结合水的能力下降。
表 2 克氏原螯虾持水率与蒸煮损失率的变化Table 2. Changes in water holding capacity and cooking loss rate of Procambarus clarkii指标 组别（℃） 无水贮藏时间（h） 0 24 48 72 持水率（%） 4 90.38±0.81Aa 89.55±4.41Aa 85.02±0.57Aab 83.41±3.95Ab 8 90.38±0.81Aa 89.12±2.09Aab 83.93±1.45Abc 82.80±4.94Ac 12 90.38±0.81Aa 90.21±0.23Aa 85.03±3.23Aa 84.67±6.06Aa 16 90.38±0.81Aa 88.50±1.93Aa 86.20±2.63Aa 85.11±4.60Aa 24 90.38±0.81Aa 89.90±1.95Aa 83.85±2.11Aa 83.80±10.9Aa 32 90.38±0.81Aa 84.66±6.03Aab 82.66±3.04Ab − 蒸煮损失率（%） 4 17.13±0.71Ac 29.51±0.72Cab 30.96±1.11Ba 28.20±0.77Bb 8 17.13±0.71Ad 25.94±0.65Dc 29.04±0.73Cb 32.11±0.97Aa 12 17.13±0.71Ad 23.03±0.44Ec 25.48±0.32Db 27.13±0.20Ba 16 17.13±0.71Ac 25.53±0.25Dab 26.35±0.19Da 24.48±1.01Db 24 17.13±0.71Ac 32.70±0.32Ba 27.96±0.43Cb 32.11±2.36Aa 32 17.13±0.71Ab 34.18±0.54Aa 34.03±0.92Aa − 2.3.2 克氏原螯虾质地品质的变化
质构是反映水产品新鲜度的品质指标之一，硬度表现为人体的触觉柔软或坚硬，弹性反映了外力作用时的变形与去力后的回复程度，咀嚼性是指咀嚼固体食物所需的能量，新鲜的肌肉蛋白质及其水化层形成的结构相对致密，咀嚼性较高[24]。无水贮藏温度对克氏原螯虾保活期肌肉质地品质变化如表3所示，虾肉硬度在32 ℃贮藏时明显下降，16~24 ℃的温度下贮藏72 h，肌肉硬度逐渐下降；随着贮藏时间的延长，虾肉弹性和咀嚼性均有一定程度地下降；随着贮藏时间的延长，4~12 ℃条件下虾尾肌肉的弹性大体上比16~32 ℃组保持在较好水平。
表 3 克氏原螯虾肌肉硬度、弹性、咀嚼性的变化Table 3. Changes in muscle hardness, elasticity, and chewability of Procambarus clarkii指标 组别（℃） 无水贮藏时间（h） 0 24 48 72 硬度
（N）4 46.68±4.04Aa 46.23±6.05ABa 27.69±3.87Cb 32.79±4.72ABb 8 46.68±4.04Aa 47.24±6.39ABa 36.90±8.48ABCa 36.53±10.33ABa 12 46.68±4.04Aa 49.43±6.14Aa 39.95±3.69Ab 38.38±3.76Ab 16 46.68±4.04Aa 47.37±4.03ABa 34.84±6.20ABCb 27.83±4.23ABb 24 46.68±4.04Aa 45.05±5.42ABab 39.43±2.83ABb 28.73±0.53ABc 32 46.68±4.04Aa 37.32±3.31Bab 28.42±7.31BCb − 弹性
（mm）4 2.04±0.22Aa 1.72±0.07ABab 1.47±0.35Bb 1.49±0.07Ab 8 2.04±0.22Aa 1.75±0.14ABab 1.59±0.15ABb 1.59±0.17Ab 12 2.04±0.22Aa 1.64±0.11ABbc 1.86±0.07Aab 1.55±0.07Ac 16 2.04±0.22Aa 1.89±0.43Aab 1.48±0.06Bb 1.58±0.11Aab 24 2.04±0.22Aa 1.64±0.22ABb 1.73±0.22Aab 1.38±0.08Bb 32 2.04±0.22Aa 1.41±0.18Bb 1.42±0.25Bb − 咀嚼性（mJ） 4 26.17±10.71Aa 22.00±2.77Aab 11.03±8.79Bb 13.07±2.95Bab 8 26.17±10.71Aa 22.33±5.68Aa 16.27±5.72ABa 16.70±8.31ABa 12 26.17±10.71Aa 20.97±3.82Aa 23.93±5.91Aa 15.70±3.86ABa 16 26.17±10.71Aa 28.27±14.83Aa 13.50±1.30ABb 11.57±2.96Bb 24 26.17±10.71Aa 20.10±9.56Aa 19.20±9.27ABa 9.63±1.94Bb 32 26.17±10.71Aa 14.13±6.91Ab 9.83±5.28Bb − 由表3可知，各温度处理组的虾肌肉硬度、弹性、咀嚼性均呈下降趋势，这可能是由于无水贮藏的克氏原螯虾受到长时间的饥饿胁迫与温度胁迫，肌原纤维蛋白被催化降解，肌肉的肌纤维的断裂和肌间结缔组织的降解，导致无水贮藏后肌肉质地变软[10,22]，这与2.3.1肌肉持水率的结果一致，说明温度对无水贮藏克氏原螯虾后肌肉的品质影响较大。
2.4 无水贮藏温度对克氏原螯虾保活期肌肉品质影响的相关性分析
无水贮藏温度对克氏原螯虾保活期肌肉品质的相关性分析如表4所示，克氏原螯虾存活率与硬度、弹性、咀嚼性均呈极显著正相关（P<0.01），与水分含量、持水率呈显著正相关（P<0.05），与蒸煮损失率呈极显著负相关（P<0.01）。存活率越高的温度组，其肌肉的硬度、弹性、咀嚼性能保持得较好，水分含量和持水率在合适的处理温度下，能得到较好的保持，蒸煮损失率随着存活率的提高而下降，蒸煮损失率越小肌肉品质越好。综合前文数据分析，在12~16 ℃温度条件下，可提高无水贮藏克氏原螯虾的肌肉保活保鲜品质。
表 4 克氏原螯虾肌肉品质变化的相关性分析Table 4. Correlation analysis of muscle quality changes of Procambarus clarkii存活率 水分含量 持水率 蒸煮损失率 硬度 弹性 咀嚼性 存活率 1 水分含量 0.303* 1 持水率 0.305* 0.239 1 蒸煮损失率 −0.408** −0.533** −0.242 1 硬度 0.448** 0.444** 0.302* −0.255 1 弹性 0.423** 0.386** 0.153 −0.279* 0.560** 1 咀嚼性 0.408** 0.364** 0.136 −0.226 0.771** 0.814** 1 注：**P<0.01，极显著相关；*P<0.05，显著相关。 2.5 无水贮藏温度对克氏原螯虾保活期肌肉乳酸与pH的影响
糖原是动物细胞内葡萄糖的贮存形式，保证了细胞应激时的能量需求，无氧条件下葡萄糖糖酵解产生的丙酮酸会在乳酸脱氢酶的催化下产生乳酸[25-26]，乳酸含量可反映组织供氧和代谢状态。新鲜水生动物肉的pH呈弱碱性，不同的压力应激下，机体产生乳酸，同时ATP在此过程中降解产生大量磷酸基团，最终导致肌肉的pH降低，pH急剧下降会影响肌肉的新鲜度[22,27]。
无水贮藏温度对克氏原螯虾肌肉保活期乳酸与pH 的影响如 图3A 和图3B 所示，与 0 h 对比，经过无水贮藏的各温度处理组乳酸含量均呈明显的先上升后下降的趋势。4 ℃处理组的pH呈先下降后上升，对应其乳酸呈先上升后下降的趋势，说明机体在无水贮藏初期无氧呼吸先增强，产生乳酸 导致肌肉pH下降，随着贮藏时间的延长机体逐渐适应低温条件，乳酸生成量降低，肌肉pH恢复正常水平。24~32 ℃组的pH随着贮藏时间的延长均呈下降趋势，12 ℃组的乳酸生成量变化平稳，8~12 ℃组pH变化幅度最小。这可能是由于温度过低或过高引起虾体应激反应，无氧呼吸增强，肌肉乳酸堆积，pH下降。糖原代谢产生乳酸并且在肌肉中累积，从而导致肌肉 pH 值急剧下降，甚至降到水生动物的死亡耐受点，机体发生死亡[28]。
图 3 克氏原螯虾肌肉乳酸与pH的变化Figure 3. Changes of lactic acid and pH in muscle of Procambarus clarkii2.6 无水贮藏温度对克氏原螯虾肌肉保活期肝胰腺抗氧化酶及氧化产物的影响
抗氧化酶的活性在动物抗氧化反应中起着重要作用[29]。SOD酶活力高低代表机体清除氧自由基的能力，已生成的 ROS 在 SOD 酶作用下转化为 H2O2和 O2；CAT 和 POD 可以将 H2O2 还原为H2O和O2；MDA是氧自由基使生物膜中的不饱和脂肪酸过氧化后的产物[8, 30]。肝胰腺是甲壳类动物重要的免疫器官，肝胰腺组织在虾机体响应环境胁迫中的作用，可作为无水保活流通过程中应激损伤效应评价的靶组织[31]。无水贮藏温度对克氏原螯虾肌肉保活期肝胰腺的抗氧化能力的影响如图4所示，无水贮藏24 h与48 h时，4、24、32 ℃贮藏虾的SOD、CAT、T-AOC酶活力显著高于8、12、16 ℃处理组（P<0.05），MDA含量显著升高（P<0.05），从6.41 nmol/mg prot升至13~15 nmol/mg prot，而8、12、16 ℃组的SOD、CAT、T-AOC的响应幅度相对4、24、32 ℃组较小，呈先上升后下降的趋势，MDA生成量显著低于4、24、32 ℃处理的克氏原螯虾（P<0.05）。72 h时，4~24 ℃处理组的氧化应激响应相对前48 h呈下降趋势。4、24、32 ℃时，由于克氏原螯虾受到温度应激，抗氧化酶含量升高以应对温度变化，调节机体代谢；8、12、16 ℃处理的克氏原螯虾进入半休眠状态，抗氧化体系的波动较小，机体氧化损伤较小，能够实现机体自身调节，保持较低的响应水平。
图 4 克氏原螯虾肝胰腺抗氧化能力的变化Figure 4. Changes of Procambarus clarkii on hepatopancreas antioxidant enzymes王博雅等[32]发现了葛氏鲈塘鳢抗氧化酶（SOD、CAT和GSH）的活性随着温度（17~31 ℃）的升高而升高。吴波等[33-34]研究在急性高温应激和运输振动下，鲈鱼的抗氧化酶减少，MDA浓度增加。MDA被视为ROS诱导的氧化损伤的生物标志物，MDA含量越高，机体承受的压力了越大[35]。T-AOC和GSH-Px是消除过量ROS的抗氧化系统的重要指标[36]。已有研究证明，空气暴露压力可能导致甲壳类动物的氧化应激和组织损伤[37]。无水胁迫与极端温度胁迫给水产动物无水贮运中产生压力，这些压力能导致氧化应激，诱导水产动物机体发生抗氧化反应[38]。本研究结果与Luo等[39]研究克氏原螯虾在急性温度应激中CAT、SOD免疫酶基因表达在受到寒冷威胁后下调，CAT、SOD在热胁迫后明显上调的结果一致。
2.7 无水贮藏温度对克氏原螯虾肌肉保活期肝胰腺非特异性免疫指标的影响
ACP和AKP是水产生物中的两种重要磷酸酶，参与外来蛋白质、碳水化合物和脂质的降解，并能与其他酶类形成水解酶系消除异物，在对虾免疫防御系统起关键作用，可作为生物抵抗环境胁迫评价的标记物[31,40]。LZM非特异性免疫系统的重要组成部分，其活力越强，溶菌能力也就越高[41]，动物自身会通过调节LZM活性来应对环境变化下的免疫功能弱化[10]。
无水贮藏温度对克氏原螯虾肌肉保活期非特异性免疫酶的影响如图5所示，克氏原螯虾机体受到高温胁迫时，ACP在24 ℃和32 ℃对比8~16 ℃处理组显著升高（P<0.05），这与Hu等[40]在研究高温和pH对厚壳贻贝的结果相似。4~16 ℃下先上升后下降，说明机体在降温之后，随着时间延长逐渐适应该温度，机体免疫能力恢复至正常水平。AKP在胁迫一段时间后下降，可能是因为在环境胁迫下，虾代谢速率提高，调节自身免疫能力以抵抗不良环境胁迫，维持生命活动正常进行[42]。LZM在高温条件下也有一定程度升高，在胁迫48 h后为逐渐下降，说明胁迫时长超过其适应范围时，溶菌酶活性下降，溶菌能力下降[43]。但32 ℃组的LZM仍保持在较高水平，说明存活的机体的溶菌酶为维持其生命体征发挥较大作用。
图 5 克氏原螯虾肝胰腺非特异性免疫酶的变化Figure 5. Changes of nonspecific immune enzymes in the hepatopancreas of Procambarus clarkii3 结论
本研究表明，温度对无水贮藏克氏原螯虾保活期的存活率影响较大，24~32 ℃条件下，克氏原螯虾存在明显的氧化应激，体现其抗氧化系统和非特异性免疫系统被激活，酶活力升高，氧化产物累积加快，随着贮藏时间延长，机体组织损耗严重，虾尾肌肉品质下降，导致死亡率升高。8~16 ℃条件下，克氏原螯虾机体代谢速率减缓，降低其机体的氧化应激反应，机体的抗氧化能力与非特异性免疫系统相关免疫酶的变化幅度较小，机体在温度应激后能够调整适应。适当温度贮藏的克氏原螯虾存活率高，存活率最佳温度为12 ℃。12~16 ℃条件下虾肌肉水分含量、持水率、硬度、弹性、咀嚼性等指标都比较可观，说明克氏原螯虾在合适的温度下进行无水贮藏，肌肉品质得到较好保持。综上所述，克氏原螯虾无水贮藏的最佳贮藏温度范围为12~16 ℃，实验结果可为后续克氏原螯虾无水保活运输提供参考。
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图 2 克氏原螯虾肌肉伪彩图（A）与横向弛豫图（B）的变化
Figure 2. Changes of pseudo color map (A) and transverse relaxation spectra (B) of Procambarus clarkii muscle
图 3 克氏原螯虾肌肉乳酸与pH的变化
Figure 3. Changes of lactic acid and pH in muscle of Procambarus clarkii
图 4 克氏原螯虾肝胰腺抗氧化能力的变化
Figure 4. Changes of Procambarus clarkii on hepatopancreas antioxidant enzymes
图 5 克氏原螯虾肝胰腺非特异性免疫酶的变化
Figure 5. Changes of nonspecific immune enzymes in the hepatopancreas of Procambarus clarkii
表 1 克氏原螯虾肌肉水分含量的变化（%）
Table 1. Changes of muscle moisture content of Procambarus clarkii (%)
组别（℃） 无水贮藏时间（h） 0 24 48 72 4 83.80±0.98Aa 81.32±0.47ABb 81.18±0.78ABb 80.13±1.63Ab 8 83.80±0.98Aa 82.43±0.30Aab 81.22±1.34ABbc 80.01±0.93Ac 12 83.80±0.98Aa 82.78±0.24Aab 82.33±0.55Ab 81.18±0.39Ac 16 83.80±0.98Aa 81.77±0.56ABb 81.36±1.11ABb 81.27±1.00Ab 24 83.80±0.98Aa 80.69±1.47BCb 80.12±0.35Bb 79.74±0.60Ab 32 83.80±0.98Aa 79.47±1.04Cb 75.82±1.20Cc − 注：同列不同大写字母代表同一贮藏时间下不同温度样品间差异显著（P<0.05）；同行不同小写字母代表同一温度下不同时间样品间差异显著（P<0.05）；表1~表3同。 
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表 2 克氏原螯虾持水率与蒸煮损失率的变化
Table 2. Changes in water holding capacity and cooking loss rate of Procambarus clarkii
指标 组别（℃） 无水贮藏时间（h） 0 24 48 72 持水率（%） 4 90.38±0.81Aa 89.55±4.41Aa 85.02±0.57Aab 83.41±3.95Ab 8 90.38±0.81Aa 89.12±2.09Aab 83.93±1.45Abc 82.80±4.94Ac 12 90.38±0.81Aa 90.21±0.23Aa 85.03±3.23Aa 84.67±6.06Aa 16 90.38±0.81Aa 88.50±1.93Aa 86.20±2.63Aa 85.11±4.60Aa 24 90.38±0.81Aa 89.90±1.95Aa 83.85±2.11Aa 83.80±10.9Aa 32 90.38±0.81Aa 84.66±6.03Aab 82.66±3.04Ab − 蒸煮损失率（%） 4 17.13±0.71Ac 29.51±0.72Cab 30.96±1.11Ba 28.20±0.77Bb 8 17.13±0.71Ad 25.94±0.65Dc 29.04±0.73Cb 32.11±0.97Aa 12 17.13±0.71Ad 23.03±0.44Ec 25.48±0.32Db 27.13±0.20Ba 16 17.13±0.71Ac 25.53±0.25Dab 26.35±0.19Da 24.48±1.01Db 24 17.13±0.71Ac 32.70±0.32Ba 27.96±0.43Cb 32.11±2.36Aa 32 17.13±0.71Ab 34.18±0.54Aa 34.03±0.92Aa −
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表 3 克氏原螯虾肌肉硬度、弹性、咀嚼性的变化
Table 3. Changes in muscle hardness, elasticity, and chewability of Procambarus clarkii
指标 组别（℃） 无水贮藏时间（h） 0 24 48 72 硬度
（N）4 46.68±4.04Aa 46.23±6.05ABa 27.69±3.87Cb 32.79±4.72ABb 8 46.68±4.04Aa 47.24±6.39ABa 36.90±8.48ABCa 36.53±10.33ABa 12 46.68±4.04Aa 49.43±6.14Aa 39.95±3.69Ab 38.38±3.76Ab 16 46.68±4.04Aa 47.37±4.03ABa 34.84±6.20ABCb 27.83±4.23ABb 24 46.68±4.04Aa 45.05±5.42ABab 39.43±2.83ABb 28.73±0.53ABc 32 46.68±4.04Aa 37.32±3.31Bab 28.42±7.31BCb − 弹性
（mm）4 2.04±0.22Aa 1.72±0.07ABab 1.47±0.35Bb 1.49±0.07Ab 8 2.04±0.22Aa 1.75±0.14ABab 1.59±0.15ABb 1.59±0.17Ab 12 2.04±0.22Aa 1.64±0.11ABbc 1.86±0.07Aab 1.55±0.07Ac 16 2.04±0.22Aa 1.89±0.43Aab 1.48±0.06Bb 1.58±0.11Aab 24 2.04±0.22Aa 1.64±0.22ABb 1.73±0.22Aab 1.38±0.08Bb 32 2.04±0.22Aa 1.41±0.18Bb 1.42±0.25Bb − 咀嚼性（mJ） 4 26.17±10.71Aa 22.00±2.77Aab 11.03±8.79Bb 13.07±2.95Bab 8 26.17±10.71Aa 22.33±5.68Aa 16.27±5.72ABa 16.70±8.31ABa 12 26.17±10.71Aa 20.97±3.82Aa 23.93±5.91Aa 15.70±3.86ABa 16 26.17±10.71Aa 28.27±14.83Aa 13.50±1.30ABb 11.57±2.96Bb 24 26.17±10.71Aa 20.10±9.56Aa 19.20±9.27ABa 9.63±1.94Bb 32 26.17±10.71Aa 14.13±6.91Ab 9.83±5.28Bb −
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表 4 克氏原螯虾肌肉品质变化的相关性分析
Table 4. Correlation analysis of muscle quality changes of Procambarus clarkii
存活率 水分含量 持水率 蒸煮损失率 硬度 弹性 咀嚼性 存活率 1 水分含量 0.303* 1 持水率 0.305* 0.239 1 蒸煮损失率 −0.408** −0.533** −0.242 1 硬度 0.448** 0.444** 0.302* −0.255 1 弹性 0.423** 0.386** 0.153 −0.279* 0.560** 1 咀嚼性 0.408** 0.364** 0.136 −0.226 0.771** 0.814** 1 注：**P<0.01，极显著相关；*P<0.05，显著相关。
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