Gene Cloning and Enzymatic Properties of an Intracellular Maltogenic Amylase from Bacillus sp. B110
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摘要: 目的：对菌株Bacillus sp. B110的胞内麦芽糖淀粉酶BMAL进行基因克隆、异源表达、纯化及酶学性质研究，为后期开发新的淀粉加工用酶打下基础。方法：使用PCR技术对Bacillus sp. B110的胞内麦芽糖淀粉酶bmal基因序列进行全长克隆，异源表达，使用Ni2+-NTA进行纯化，再对其酶学特性进行测定，使用序列分析工具BioEdit、MEGA等对其氨基酸序列进行分析，使用AlphaFold2对其三级结构进行预测分析。结果：BMAL基因全长1770 bp，编码一个589氨基酸残基的蛋白。重组酶rBMAL经Ni2+-NTA亲和层析纯化后，SDS-PAGE电泳结果显示其分子量大小为63 kDa。氨基酸序列分析和三维建模表明BMAL与来源于B.subtilis 168和B.subtilis SUH4-2的麦芽糖淀粉酶有较高的一致性，且BMAL具有一个麦芽糖淀粉酶所独有的N端结构域以及由Asp328-Glu357-Asp424三个氨基酸残基所构成的催化中心。重组酶rBMAL最适反应温度为45 ℃，最适反应pH为6.0。重组酶rBMAL在30 ℃条件下保藏7 h残留酶活为60%，但在60 ℃条件下保藏2 h残留酶活力下降98%，说明BMAL对热敏感。重组酶rBMAL在4 ℃，pH7.0~9.5保藏12 h活性稳定。当存在1 mmol/L的金属离子Mg2+时，重组酶rBMAL活力提高36%，而Ni2+、Fe3+、Co2+、Cu2+、Zn2+、Al3+、Ca2+对重组酶rBMAL有抑制作用，酶活力减少85%~48%。有机溶剂和化学试剂甲醇、乙醇、丙酮、异腈、EDTA和SDS对重组酶rBMAL有较强的抑制作用，酶活力减少至32.3%~64.8%。底物特异性实验结果证实BMAL最适底物为环精糊。结论：Bacillus sp. B110的胞内麦芽糖淀粉酶BMAL具有良好的催化特性和pH稳定性，在面包烘焙工业上具有潜在的应用价值。
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关键词:
- Bacillus sp. B110 /
- BMAL /
- 麦芽糖淀粉酶 /
- 基因克隆 /
- 酶学特性
Abstract: Objective: To study enzymatic properties of intracellular maltogenic amylase (BMAL) in Bacillus sp. B110, purification, gene cloning, heterologous expression and purification were performed. It laid a foundation for later research on the development of new starch processing enzymes. Method: The full-length of BMAL gene was amplified by PCR and over-expressed and heterologous expressed in Escherichia coli. The recombinant enzyme was purified with nickel affinity chromatography (Ni2+-NTA), and its enzymatic characteristic were determined. The amino acid sequence of BMAL was analyzed by sequence analysis tools BioEdit and MEGA tools, and the three-dimensional model was predicted by alpha fold2. Results: The nucleotide sequence analysis revealed an open reading frame (ORF) of 1770 bp encoded a putative protein of 589 aa residues. The recombinant enzyme was purified with nickel affinity chromatography (Ni2+-NTA). SDS-PAGE analysis of the purified enzyme revealed that the molecular mass of BMAL was 63 kDa. The primary structure of BMAL was similar to those of MAases from B. subtilis 168 and B. subtilis SUH4-2, such as possession of an extra domain at its N-terminal and had a catalytic triad Asp328-Glu357-Asp424. The purified recombinant enzyme rBMAL had an optimum temperature of 45 ℃ and an optimum pH around 6.0. The rBMAL retained about 60% activity after 7 h of incubation at below 30 ℃, but it lost 98% of the original activity after 2 h of incubation at 60 ℃. These results revealed that the rBMAL was inthermostability. The activity of rBMAL was stable in pH7.0~9.5 at 4 ℃ for 12 h. In the presence of 1 mmol/L metal ion Mg2+, the activity of rBMAL increased by 36%, while 1 mmol/L Ni2+, Fe3+, Co2+, Cu2+, Zn2+, Al3+, Ca2+ inhibited the activity of rBMAL, which decreased by 85%~48%. The recombinant enzyme activity was inhibited by methanol, acetone, ethanol, acetonitrile, EDTA and SDS, and the enzyme activity was decreased to 32.3%~64.8%. Conclusion: The intracellular maltose amylase BMAL from Bacillus sp. B110 had high catalytic capacity and pH stability, which had potential application in bread baking industry.-
Key words:
- Bacillus sp. B110 /
- BMAL /
- maltogenic amylase /
- gene cloning /
- enzymatic properties
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麦芽糖淀粉酶（EC. 3.2.1.133）是α-淀粉酶的成员之一，与常见的α-淀粉酶相比，麦芽糖淀粉酶具有独特的催化特点和多功能活性[1]。麦芽糖淀粉酶可以催化淀粉、糖原等底物中的α-1,4、α-1,6糖苷键水解；也可通过转糖基反应作用于α-1,4、α-1,3、α-1,6糖苷键生成寡糖；此外，麦芽糖淀粉酶对α-淀粉酶的抑制剂阿卡波糖也有水解作用[2]。麦芽糖淀粉酶可以水解淀粉和环糊精生成麦芽糖，并以普鲁兰糖为底物生成潘糖[3]。麦芽糖淀粉酶在支链低聚糖混合物、新型碳水化合物的生产和药物的糖基化修饰上有重要意义，在食品、医药等行业都有广泛的应用[4]。特别是在面包工业上，面包在储存的过程中，会因为脱水和淀粉的重结晶而老化变质，影响其口感和消化率[5]。而麦芽糖淀粉酶可以减缓面包的老化，改善面包在储存期间的品质，具有最广泛的应用前景[6-7]。
根据氨基酸序列的保守性和底物特异性，麦芽糖淀粉酶与环糊精酶（CDase，EC3.2.1.54）、新普鲁兰酶（EC 3.2.1.135）被划分为同一类，归属于糖苷水解酶GH13家族的第20亚家族GH13-20[8-9]。与典型的α-淀粉酶相比，这些酶含有一个独有的由130个氨基酸残基构成的N端结构域，该N端结构域参与同源二聚体的形成[10]。
迄今为止，已报道的归属于GH13-20家族的麦芽糖淀粉酶并不多，且多为胞内酶，而常见的产麦芽糖的α-淀粉酶如来源于Rhizomucor miehei的RmAmyA[11]、来源于Bacillus licheniformis So-B3的α-淀粉酶等[12]则多为胞外酶。来源于Bacillus stearothermophilus ET1的麦芽糖淀粉酶BSMA可以水解淀粉、普鲁兰和环糊精、阿卡波糖等底物中的α-1,4、α-1,3、α-1,6糖苷键，也可通过转糖苷作用形成新的α-1,3、α-1,4、α-1,6糖苷键[8]。来源于Thermus sp.IM6501的麦芽糖淀粉酶ThMA作用机制与BSMA一致[13]。来源于B. licheniformis的麦芽糖淀粉酶BLMA、B. subtilis SUH 4-2的麦芽糖淀粉酶BBMA，Thermoplasma volcanium GSS1的麦芽糖淀粉酶TVMA则不能作用于α-1,3糖苷键，只能水解或转糖苷作用于α-1,4、α-1,6糖苷键[10,14-15]。来源于Lactobacillus gasseri ATCC 33323的麦芽糖淀粉酶LGMA可以水解生淀粉和可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉和糖原，但不能降解普鲁兰和β-环糊精[16]，来源于Palaeococcus ferrophilus的麦芽糖淀粉酶AMPf则水解淀粉生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和麦芽糖，但几乎不作用于环糊精和普鲁兰糖，显示出独特的底物特异性[17]。来源于Corallococcus sp. EGB的麦芽糖淀粉酶CoMA归属于GH13_36亚家族，可以催化低聚麦芽糖和可溶性淀粉生成高纯度的麦芽糖，显示出独特的作用机制[18]。
本实验室之前分离的一株芽孢杆菌Bacillus sp. B110对多种碳水化合物具有良好的水解特性[19]。通过基因组测序和生物信息学分析，发现其基因组中有一个开放阅读框orf684，（GenBank Submission ID: 2604726），其编码产物经序列分析为胞内麦芽糖淀粉酶（BMAL， Bacillus sp. B110 maltogenic amylase）。本研究对其进行了异源表达和生化特性的表征，以期丰富麦芽糖淀粉酶资源，为工业化应用提供基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
Bacillus sp.B110、克隆宿主菌株Escherichia coli DH5α、表达宿主菌株E.coli BL21（DE3）、表达质粒载体pET29a 均为本实验室保藏；LB培养基（g/L）：酵母粉5.0、胰蛋白胨10.0、NaCl 10.0、pH7.0~7.2；高保真酶PrimerSTAR、限制酶Nde I、Xho I、T4 DNA连接酶、IPTG、Ni2+-NTA柱材等 北京宝日医生物科技有限公司；引物合成及核酸测序委托湖南擎科生物科技有限公司完成；琼脂糖、酵母粉、胰蛋白胨、卡那霉素、溴酚蓝、考马斯亮蓝R-250、可溶性淀粉、β-环糊精、普鲁兰糖、直链淀粉、β-巯基乙醇、甘氨酸、咪唑、柠檬酸、DNA分子量标准、低分子量蛋白标准、质粒提取试剂盒、DNA凝胶纯化回收试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；NaCl、磷酸氢二钠，磷酸二氢钠、SDS、过硫酸铵、TEMED、NaOH、Tris-HCl、二硝基水杨酸、葡萄糖、甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈、SDS、Tween 80、Triton X-100、EDTA等试剂 均为国产分析纯，西陇化工股份有限公司。
T100梯度PCR仪、Mini Protean 3 Cell蛋白垂直电泳仪 美国Bio-Rad；DYCP-31DN核酸电泳仪 北京六一；Allegra X-22R高速冷冻离心机 美国Beckman Coulter；Tanon 1600凝胶成像系统 上海天能；HS-840-U超净工作台 苏州安泰；超声波细胞破碎仪JY99-11D 宁波新芝；T1系列可见分光光度计 上海屹普。
1.2 实验方法
1.2.1 表达载体pET29a-BMAL的构建
根据基因组测序结果，设计PCR扩增引物为BMAL-F：GGAATTCCATATGGAATAT GCAGCGATTCATC（下划线位置碱基为Nde I酶切位点，5'端加保护碱基）和BMAL-R：CCGCTCGAGGTACAGGGGCGGCAGCACTC（下划线位置碱基为Xho I酶切位点，5'端加保护碱基）。以Bacillus sp. B110总DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增条件为预变性95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，总共进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经0.75%琼脂糖凝胶电泳，DNA凝胶试剂盒回收后以Nde I/Xho I双酶切消化。酶切产物与同样双酶切的pET29a载体以T4 DNA连接酶进行酶连，构建表达载体。酶连产物热激转化至E. coli DH5α，构建重组克隆菌株E. coli DH5α（pET29a-BMAL）。阳性克隆送湖南擎科生物科技有限公司测序。
1.2.2 BMAL序列分析
将BMAL氨基酸序列提交至NCBI，选择Uniprot和PDB数据库进行比对，下载相似度高的蛋白序列。多序列比对采用Bioedit7.0软件，系统进化树绘制采用MEGA11软件。将BMAL氨基酸序列提交至alpha fold2在线分析网站，构建蛋白三维模型，所得结果以PyMoL2.5进行可视化分析，以Autodock软件进行分子对接。
1.2.3 重组酶的表达与纯化
将测序正确的重组质粒pET29a-BMAL热激转化至E. coli BL21（DE3），构建表达菌株。阳性克隆按1%接种至LB液体培养基（含有终浓度为50 mg/L的卡那霉素），37 ℃，180 r/min培养至OD600为0.6，加入IPTG（终浓度为0.2 mmol/L），16 ℃诱导24 h。5000 r/min离心20 min收集菌体，以50 mmol/L PBS缓冲液（pH7.0）重悬，超声波破碎（破碎条件：300 W，70次，超声5 s，间隙5 s，总时间为10 min）后12000 r/min 4 ℃离心15 min，上清液以Ni2+-NTA亲和层析柱进行纯化[20]。以SDS-PAGE电泳检测表达情况[21]，蛋白含量测定采用Bradford法[22]。
1.2.4 重组酶rBMAL最适反应pH和pH稳定性的测定
纯化的重组蛋白rBMAL在4 ℃下以50 mmol/L PBS缓冲液（pH7.0）透析12 h去除咪唑，以1%可溶性淀粉为底物，在40 ℃反应条件下，pH分别为4.0、5.0、5.5、6.0的柠檬酸缓冲液，pH为6.0、6.5、7.0的磷酸盐缓冲液，pH为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的Tris-HCl缓冲液中反应5 min，三个重复，DNS法测定酶活[23]，以最高酶活力为100%进行比较。将重组酶在不同pH（3.0~11.0）的缓冲液中，4 ℃下孵育12 h，取适量酶液加入至pH6.0的反应体系中反应5 min，DNS法测定酶活，以最高酶活力为100%，比较重组酶在不同pH条件下的稳定性。
酶活力定义：在40 ℃反应体系下，每分钟催化生成1 µmol麦芽糖所需要的蛋白质含量（mg）为1个酶活力单位。
1.2.5 重组酶rBMAL最适反应温度和温度稳定性的测定
取适量纯化的重组酶，加入含有底物并预热的反应体系，在20、30、40、50、60 ℃条件下反应5 min后，三个重复、DNS法测定酶活，以最高酶活力为100%进行比较。
将酶液分别于0、20、30、40、50、60 ℃保温不同时间后取样，于最适反应温度条件下反应，测定酶活力。以未经热处理的酶液为对照（100%），比较重组酶在不同温度条件下的稳定性[24]。
1.2.6 化学试剂、金属离子对重组酶rBMAL的影响
取适量纯化的重组酶，加入至含有终浓度为1 mmol/L的Al3+、Fe3+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Ni2+、K+、Mn2+、Mg2+、Ca2+金属离子和不同化学试剂（10%甲醇、10%乙醇、10%丙酮、10%异丙醇、10%乙腈、2 mg/mL SDS、20 mg/mL Tween 80、20 mg/mL Triton X-100、10 mmol/L EDTA）的反应体系中，pH6.0、40 ℃反应5 min，以不加金属离子和化学试剂的反应体系为对照（100%），测定金属离子、化学试剂对重组酶活性的影响。
1.2.7 重组酶rBMAL的底物特异性
取适量重组酶液分别加入至底物终浓度为1、2、4、5、8、10、20 mg/mL的可溶性淀粉、β-环糊精、普鲁兰糖、直链淀粉的反应体系中，最适的条件下反应5 min，根据1/[S]和1/[V]绘制Lineweaver-Burk曲线，计算不同底物的Km等表观动力学常数[18]。
1.3 数据处理
每组实验重复3次并取平均值，实验结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 17.0进行数据处理与分析
2 结果与分析
2.1 重组菌株E. coli BL21（DE3）-pET29a-BMAL的构建
以Bacillus sp. B110总DNA为模板进行PCR扩增，扩增结果如图1所示。PCR扩增得到与预期大小相符的DNA片段（1770 bp）。凝胶纯化后的PCR产物经Nde I和Xho I双酶切，与同样双酶切的pET29a进行酶连。酶连产物转化至E. coli DH5α，阳性克隆测序无误后，转化至E. coli BL21（DE3），重组菌株诱导表达后，以Ni2+-NTA进行亲合层析，分别以含50、100、200 mmol/L咪唑的PBS缓冲液（pH7.0）进行洗脱。SDS-PAGE电泳结果见图2，在经50 mmol/L咪唑洗脱的样品中仍有少许杂蛋白，在经200 mmol/L咪唑洗脱的样品显示出较高的纯度，纯化的重组酶分子量大小为63 kDa。
图 2 纯化BMAL的SDS-PAGE分析注：1.蛋白分子质量标准；2.总蛋白；3. 50 mmol/L咪唑洗脱液；4. 50 mmol/L咪唑洗脱液；5. 200 mmol/L咪唑洗脱液。Figure 2. SDS-PAGE analysis of the purified BMAL2.2 麦芽糖淀粉酶BMAL序列分析
将BMAL氨基酸序列与NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）以及蛋白数据库Protein Data Bank（PDB）的蛋白序列进行同源性比对，与已报道的麦芽糖淀粉水解酶、环糊精水解酶以邻接法构建系统发育树，结果见图3。
图 3 邻接法构建BMAL和其它来源环糊精酶的系统发育树Figure 3. Phylogenetic tree of BMAL and related CDases obtained from different sources constructed by the neighbor-joining methodBMAL属于糖苷水解酶GH13家族，与来源于Bacillus subtilis SUH4-2的胞内麦芽糖淀粉酶BBMA[10]、Bacillus subtilis 168的胞外麦芽糖淀粉酶[25]一致性达98%，在系统进化树上属于同一分支，但Bacillus subtilis 168的胞外麦芽糖淀粉酶没有酶学特性的报道。BMAL与来源于Staphylothermus marinus的麦芽糖淀粉酶SMMA一致性较低（29.04%）[26]，表明古细菌来源的麦芽糖淀粉酶具有较远的亲缘关系。此外，BMAL与来源于Bacillus licheniformis的麦芽糖淀粉酶BLMA（43.3%）[27]、Bacillus acidopullulyticus麦芽糖淀粉酶（45.17%）、Bacillus sp. A2-5a的环糊精水解酶（47.68%）[28]、Geobacillus stearothermophilus的麦芽糖淀粉酶BSMA（51.03%）[8]、Bacillus stearothermophilus的异普鲁兰酶（51.37%）[29]、Thermus sp. IM6501的麦芽糖淀粉酶THMA（53.26%）[30]、Geobacillus sp. MAS1的环糊精水解酶GTCDase（53.26%）[31]一致性均在60%以下。
利用信号肽预测网站（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）预测BMAL的N端有无信号肽序列，并将BMAL氨基酸序列提交至alpha fold2在线网站（https://cryonet.ai/af2/），预测其三维结构。如图4a所示，BMAL无信号肽，由三个结构域组成，N端结构域Domain N（1-130）是麦芽糖淀粉酶独有的结构域，与二聚体的形成有关；Domain B是催化域；C端结构域Domain C为碳水化合物结合模板{Kim，1999 #28}。催化结构域Domain B具有α淀粉酶GH13家族典型的（β/α）8桶状结构，将预测得到的Domain B的pdb结构文件与底物分子麦芽六糖、产物分子潘糖以Autodock软件进行分子对接，底物分子麦芽六糖位于BMAL凹陷的口袋处（图4b），且与底物口袋处的Asp328-Glu357-Asp424邻近（图4c）。如图4d所示，产物分子与活性中心三联体残基Asp328-Glu357-Asp424形成催化网络，同时Arg472也参与了催化过程。BMAL的结构特征和催化中心与来源于Bacillus subtilis SUH4-2的胞内麦芽糖淀粉酶BBMA[10]、Bacillus subtilis 168的胞外麦芽糖淀粉酶[25]一致。同时，BMAL具有α-淀粉酶的4个经典的保守域Region I（245DAVFNH250）、Region II （323DGWRLDVANE332）、Region III（356GEIWH360）和Region IV（418NLLD（G）SHDT425），其中，催化中心三个氨基酸残基Asp328-Glu357-Asp424分别位于保守区II、III和IV，且在整个α-淀粉酶家族中非常保守。除此之外，BMAL、BBMA、BSMA和ThMA具有的N端结构域Domain N（1-130）以及三个保守区141YQIFPERFAN150、208HKYDT212和365WLRGDEFHAAMNYP378为糖苷水解酶GH13-20亚家族所独有，表明BMAL归属于糖苷水解酶GH13-20亚家族。
图 4 BMAL的三维结构图注：a.BMAL飘带图；b.BMAL与底物麦芽六糖分子对接；c.BMAL与潘糖分子对接图；d.活性中心。Figure 4. 3D structure of BMAL2.3 重组酶rBMAL的催化特性
以可溶性淀粉为底物，对重组酶rBMAL的催化特性进行测定，结果见图5。重组酶rBMAL的最适反应pH为6.0（图5a）；在pH为8~9条件下保存12 h稳定，其残留酶活为最适pH保存条件的93%以上，当pH为7.0和pH为9.5时，残留酶活分别为75.67%和72.97%（图5b）；重组酶rBMAL的最适反应温度为45 ℃（图5c）；重组酶rBMAL对温度条件敏感，在60 ℃条件下保存2 h后，残留酶活仅为2.73%，在30 ℃条件下保存7 h残留酶活为60.71%（图5d）。来源于Bacillus subtilis SUH4-2的胞内麦芽糖淀粉酶BBMA的最适反应pH为7.0，最适反应温度为40~45 ℃，在pH为6~8条件下稳定，BMAL和BBMA的理化特性显示出细微的差别。
图 5 pH和温度对重组酶rBMAL的影响注：a. rBMAL的最适反应pH；b. rBMAL在不同pH缓冲液中的稳定性；c. rBMAL的最适反应温度； d.rBMAL的温度稳定性。Figure 5. Effects of pH and temperature on the recombinant rBMAL2.4 金属离子和化学试剂对重组酶rBMAL的影响
为了考察金属离子和化学试剂对重组酶rBMAL酶活的影响，在反应体系中加入不同的金属离子和化学试剂，以不添加任何试剂的反应组为对照，测定相对酶活，结果见表1。重组酶rBMAL活性受到Ni2+、Fe3+、Co2+、Cu2+、Zn2+、Al3+的强烈抑制，在添加有1 mmol/L这几种离子的情况下，酶活力分别为31.44%、23.29%、15%、26.15%、36.8%和34.04%。Mg2+对酶活有很强的激活作用，其相对酶活为136.77%，但在含有1 mmol/L Ca2+的情况下，相对酶活仅为52.23%。BMAL的酶活受到Mg2+的激活作用，但被Ca2+所抑制。来源于Corallococcus sp. EGB的麦芽糖淀粉酶CoMA的活性不依赖Ca2+和Mg2+，但受到Mn2+的激活[18]。研究表明一定量的Ca2+ 可以提高α-淀粉酶的活性以及稳定性[8]。与BBMA不同的是，BBMA在5 mmol/L的EDTA存在的情况下，酶活力提升了1.7倍[10]。而EDTA对BMAL的酶活有显著抑制作用，同时也表明BMAL确实是金属依赖的淀粉酶，但所依赖的并非Ca2+。BMAL的活性是否依赖于Mg2+以及Mg2+的结合位点需要进一步通过晶体结构分析和定点突变来验证。
表 1 金属离子和化学试剂对重组酶rBMAL酶活力的影响Table 1. Effect of metal ions and chemical reagents on the activity of rBMAL金属离子（1 mmol/L） 相对酶活（%） 化学试剂 相对酶活（%） CK 100±1.22b CK 100.00±6.94a Al3+ 34.04±0.32de Methanol 32.33±3.75f Fe3+ 23.29±3.10f Ethanol 55.43±4.67e Zn2+ 36.80±1.82d Acetone 58.96±4.45de Co2+ 15.00±3.01g Isopropanol 54.22±0.82e Cu2+ 26.15±3.35f Acetonitrile 67.00±3.21c Ni2+ 31.14±4.60e SDS 80.80±2.43b K+ 56.10±1.81c Tween 80 98.53±3.64a Mn2+ 98.91±1.08b TritonX-100 97.94±4.56a Mg2+ 136.77±0.41a EDTA 63.82±3.37cd Ca2+ 52.23±1.82c 注：采用邓肯氏新复极差法检验进行统计分析，不同小写字母表示差异显著，P<0.05。 有机溶剂甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、异丙醇等对重组酶rBMAL活性都有较强的抑制作用，Triton X-100对rBMAL酶活无显著影响。在加入EDTA的处理组中，残留酶活仅为63.82%。
2.5 重组酶rBMAL的底物特异性
分别以可溶性淀粉、直链淀粉、普鲁兰糖、β-环糊精为底物，测定其Km值、kcat值等表观动力学常数，结果见表2。BMAL对β-环糊精的Km值为2.85，对普鲁兰糖的Km值为3.35说明其对β-环糊精的亲和力最大。重组酶rBMAL可以水解可溶性淀粉、直链淀粉、普鲁兰糖、β-环糊精等底物，但最适底物为β-环糊精，与已报道的麦芽糖淀粉酶BLMA、BBMA、MAUS149等催化功能一致[1]，但与最适底物为淀粉的AMPf不同[17]。
表 2 重组酶rBMAL的动学常数Table 2. Apparent kinetic constants of rBMAL底物 单位酶活
（U·mg−1）Km
（mg·mL−1）kcat
（s−1）kcat/Km
（mL·mg−1·s−1）可溶性淀粉 32.5 20.2 143.33 7.10 直链淀粉 24 15.89 119.07 7.49 普鲁兰糖 68.2 3.35 302.09 90.18 β-环糊精 85 2.85 374.85 131.53 3 结论
麦芽糖淀粉酶可以有效地延缓面包制品的老化、延长面包的货架期，因此在烘焙工业上有广泛的应用[32]。本研究对来源于菌株Bacillus sp. B110的胞内麦芽糖淀粉酶BMAL进行了基因克隆、异源表达和纯化。BMAL最适反应pH为6.0，最适反应温度45 ℃，在pH7.0~9.5稳定。与来源于Bacillus sp. US149的麦芽糖淀粉酶MAUS149[1]、Thermoplasma volcanium GSS1的麦芽糖淀粉酶TpMA[15]相比，BMAL的热稳定性不高，但酶活力高于MAUS149和TpMA，且BMAL具有较宽的pH稳定性，表明BMAL更适合酶的固定化和保藏，在工业上具有潜在的应用价值。近年来，通过分子改造提升麦芽糖淀粉酶的热稳定性已成为热点，通过分析氨基酸序列和三维结构的差异，理性设计改造关键氨基酸残基以提高BMAL的热稳定性是下一步的研究目标。
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图 2 纯化BMAL的SDS-PAGE分析
注：1.蛋白分子质量标准；2.总蛋白；3. 50 mmol/L咪唑洗脱液；4. 50 mmol/L咪唑洗脱液；5. 200 mmol/L咪唑洗脱液。
Figure 2. SDS-PAGE analysis of the purified BMAL
图 3 邻接法构建BMAL和其它来源环糊精酶的系统发育树
Figure 3. Phylogenetic tree of BMAL and related CDases obtained from different sources constructed by the neighbor-joining method
图 4 BMAL的三维结构图
注：a.BMAL飘带图；b.BMAL与底物麦芽六糖分子对接；c.BMAL与潘糖分子对接图；d.活性中心。
Figure 4. 3D structure of BMAL
图 5 pH和温度对重组酶rBMAL的影响
注：a. rBMAL的最适反应pH；b. rBMAL在不同pH缓冲液中的稳定性；c. rBMAL的最适反应温度； d.rBMAL的温度稳定性。
Figure 5. Effects of pH and temperature on the recombinant rBMAL
表 1 金属离子和化学试剂对重组酶rBMAL酶活力的影响
Table 1. Effect of metal ions and chemical reagents on the activity of rBMAL
金属离子（1 mmol/L） 相对酶活（%） 化学试剂 相对酶活（%） CK 100±1.22b CK 100.00±6.94a Al3+ 34.04±0.32de Methanol 32.33±3.75f Fe3+ 23.29±3.10f Ethanol 55.43±4.67e Zn2+ 36.80±1.82d Acetone 58.96±4.45de Co2+ 15.00±3.01g Isopropanol 54.22±0.82e Cu2+ 26.15±3.35f Acetonitrile 67.00±3.21c Ni2+ 31.14±4.60e SDS 80.80±2.43b K+ 56.10±1.81c Tween 80 98.53±3.64a Mn2+ 98.91±1.08b TritonX-100 97.94±4.56a Mg2+ 136.77±0.41a EDTA 63.82±3.37cd Ca2+ 52.23±1.82c 注：采用邓肯氏新复极差法检验进行统计分析，不同小写字母表示差异显著，P<0.05。 
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表 2 重组酶rBMAL的动学常数
Table 2. Apparent kinetic constants of rBMAL
底物 单位酶活
（U·mg−1）Km
（mg·mL−1）kcat
（s−1）kcat/Km
（mL·mg−1·s−1）可溶性淀粉 32.5 20.2 143.33 7.10 直链淀粉 24 15.89 119.07 7.49 普鲁兰糖 68.2 3.35 302.09 90.18 β-环糊精 85 2.85 374.85 131.53
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